基于实时活细胞成像技术对单克隆疫苗菌株的筛选

《Journal of Virological Methods》：Screening of Monoclonal Vaccine Strains Based on Real-Time Live-Cell Imaging Technology

猴痘疫苗候选株的活细胞成像筛选与免疫评估

　　在当前全球气候持续变化的背景下，新兴传染病的爆发频率显著上升，其中猴痘、寨卡热和登革热等疾病对公共卫生构成了严峻挑战。为应对这一趋势，疫苗研发领域正面临新的需求，即快速获取具有高免疫原性、安全性和遗传稳定性的疫苗株，特别是用于活疫苗的开发。活疫苗因其能够激发强烈的免疫应答，广泛应用于传染病防控中，但其制备过程通常涉及复杂的筛选步骤。其中，斑块纯化（plaque purification）是传统活疫苗和重组病毒疫苗研发中的关键环节，旨在从病毒克隆混合群体中筛选出具有均一特征和理想免疫反应的疫苗株。然而，传统斑块纯化过程耗时费力，需要大量的人工操作，限制了其效率和可重复性。为解决这一问题，本研究引入了活细胞成像技术，结合基因编辑手段，以提高斑块纯化过程的效率和准确性。

研究团队基于中国科学家开发的天花疫苗株Tiantan vaccinia virus（VTT），利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对病毒基因组进行改造，删除了C12L-K2L基因簇，并插入了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，构建了重组VTT病毒（VTT-WS01-EGFP）。该病毒株的构建使得研究人员能够在斑块形成过程中实时监测荧光信号，从而实现对病毒克隆的快速筛选和纯化。随后，通过传统斑块法进行了9轮筛选，获得了50个候选克隆。为了进一步提高筛选效率和准确性，研究团队采用了Incucyte S3活细胞成像分析系统，该系统具备高通量、高灵敏度和自动化的特点，能够对候选克隆进行精确的动态评估。通过同时采集明场和荧光信号，研究人员成功筛选出31个纯化的重组病毒克隆，避免了母株病毒的污染。

这些纯化后的病毒克隆随后被用于免疫学评估。在动物实验中，4周龄的BALB/c小鼠接受了1×10? PFU剂量的疫苗接种，接种间隔为28天。接种后第42天，收集小鼠血清以检测针对VTT病毒的中和抗体水平以及针对猴痘病毒（MPXV）保护性抗原的特异性IgG抗体。实验结果显示，克隆49在中和抗体滴度方面表现突出，其滴度与传统VTT疫苗（1×10? PFU）相当，且在抗MPXV抗原的IgG滴度方面也表现出较高的水平。这一发现表明，克隆49不仅保留了VTT疫苗株的强免疫诱导能力，还具有针对猴痘病毒的交叉免疫反应潜力，因此被认为是一个有前景的猴痘疫苗候选株。

在研究过程中，活细胞成像技术的应用显著提高了筛选效率。传统的斑块法虽然能够实现病毒克隆的分离，但其操作繁琐，且难以准确评估克隆的纯度和稳定性。而Incucyte S3系统通过实时监测斑块形成过程，结合明场和荧光信号，能够动态捕捉病毒在细胞中的复制行为和感染模式。这一技术不仅能够识别纯化的病毒克隆，还能够区分不同克隆之间的感染效率、斑块大小和形态特征。通过多参数分析，研究人员能够更全面地评估病毒的特性，为疫苗株的选择提供科学依据。

此外，活细胞成像技术在病毒研究中的应用远不止于斑块纯化。它在细胞增殖、迁移、侵袭、细胞毒性以及转染效率的检测中也展现出广泛的应用前景。例如，通过监测细胞在病毒感染后的融合情况和荧光信号强度，研究人员可以判断病毒的复制能力及其对宿主细胞的影响。这种实时、动态的监测方式，相较于传统的终点法，能够提供更丰富的数据，有助于更深入地理解病毒的生物学行为。同时，该系统还支持与荧光染料（如Annexin V）结合使用，实现对细胞存活状态的精确评估，进一步提升了实验的准确性。

在本研究中，活细胞成像技术不仅优化了疫苗株的筛选流程，还为病毒复制机制的研究提供了新的视角。研究人员通过分析不同克隆的斑块形成动态，发现某些克隆能够快速感染细胞并形成较大的斑块，而另一些则表现出较慢的感染速度和较小的斑块。这些差异可能与病毒的基因变异、复制效率或免疫逃逸能力有关。通过对比不同克隆的荧光信号强度和斑块面积，研究团队能够识别出具有较高免疫原性和较低细胞毒性的候选株，为后续疫苗开发提供了关键数据支持。

值得一提的是，本研究中使用的Incucyte S3系统具有高度的灵活性和适用性，能够支持多种实验格式，包括6至96孔板，从而大幅提升了实验的高通量能力。该系统能够自动采集图像并生成动态曲线，减少了传统实验中繁琐的样本处理和数据整理步骤，显著提高了实验效率。同时，其高灵敏度的荧光检测能力，使得研究人员能够更准确地识别出具有特定特征的病毒克隆，从而提高了筛选的可靠性。

在动物免疫实验中，研究人员还发现，当接种剂量增加到3×10? PFU时，某些克隆的中和抗体和特异性IgG抗体水平显著提升，特别是针对MPXV的B6R和M1R抗原。这一结果提示，病毒的免疫诱导能力可能与其接种剂量密切相关，同时也为优化疫苗接种方案提供了参考。尽管克隆49在中和抗体滴度方面表现最佳，但在针对M1R抗原的IgG滴度方面，其水平略低于克隆11。这可能与不同病毒克隆中MV（成熟病毒）和EV（包膜病毒）的比例差异有关，因为MV和EV在病毒传播和免疫应答中可能发挥不同的作用。这一现象表明，病毒的免疫原性不仅取决于其整体复制能力，还可能与病毒颗粒的组成和功能特性有关，进一步强调了对病毒基因组进行深入研究的重要性。

本研究还指出，猴痘病毒属于正痘病毒科，与天花病毒同属该科，因此在疫苗研发中，VTT病毒株具有天然的优势。然而，传统VTT疫苗株可能伴随一定的安全性问题，例如引起皮疹、发热、眼部感染等不良反应。因此，通过基因编辑技术对VTT进行改造，使其具有更低的毒力和更高的安全性，是当前疫苗研究的重要方向。在本研究中，通过删除C12L-K2L基因簇，研究人员成功降低了病毒的致病性，同时保留了其免疫原性。这一策略为开发更安全的活疫苗提供了可行的路径。

随着全球范围内猴痘疫情的持续扩散，加强病毒监测和防控措施显得尤为重要。野生动物，尤其是啮齿类动物，是正痘病毒的天然宿主和潜在传播源。因此，系统性的野生动物监测，包括病毒基因组分析和血清学检测，对于及时发现病毒变异并制定相应的防控策略具有重要意义。此外，动物园和农场中的动物可能成为病毒传播的“哨兵”和“放大器”，特别是在人与动物密切接触的环境中，这些动物的感染状态可以作为人类感染的早期预警信号。因此，针对高风险动物群体进行疫苗接种，可能有助于阻断病毒从动物向人类的传播路径。

本研究的成果不仅为猴痘疫苗的开发提供了新的思路，也为其他活疫苗和病毒载体疫苗的筛选提供了技术参考。活细胞成像技术的引入，使得病毒克隆的筛选过程更加高效和精准，同时为病毒复制机制的研究提供了新的工具。未来，随着该技术的进一步优化和推广，其在疫苗研发、病毒学研究以及疾病防控领域的应用将更加广泛。此外，活细胞成像技术还可用于研究其他病毒的传播机制，例如单纯疱疹病毒（HSV-2）在神经节中的潜伏和复发机制，为病毒的长期研究提供了新的可能性。

总之，本研究通过基因编辑和活细胞成像技术的结合，成功构建并筛选出具有高免疫原性和低细胞毒性的重组VTT病毒株。这一成果不仅为猴痘疫苗的开发提供了重要的候选株，还展示了活细胞成像技术在病毒研究和疫苗筛选中的巨大潜力。随着技术的不断进步，未来的疫苗研发将更加依赖于这种高效、精准的筛选方法，从而加速新疫苗的问世，提高应对新兴传染病的能力。