RNA结合蛋白PTBP1通过调控硫酸乙酰肝素3-O-磺基转移酶基因剪接介导HSV-1病毒感染的新机制

《Cell & Bioscience》：RNA-binding protein PTBP1 mediates HSV-1 attachment and infection through regulation of heparan sulfate 3-O-sulfotransferase gene expression

本研究揭示了RNA结合蛋白PTBP1（多聚嘧啶区结合蛋白1）通过调控HS3ST3A1/HS3ST3B1基因前体mRNA剪接，影响硫酸乙酰肝素3-O-磺酸化修饰，进而介导单纯疱疹病毒1型（HSV-1）宿主细胞附着和感染的分子机制。研究人员发现PTBP1基因敲除导致细胞对HSV-1感染产生抵抗，而通过agomiR-124抑制PTBP1表达可显著缓解小鼠疱疹性角膜炎症状，为抗病毒治疗提供了新靶点。

　　

在病毒与宿主相互作用的复杂网络中，单纯疱疹病毒1型（HSV-1）作为一种常见的人类病原体，其感染机制一直是研究的热点。这种病毒能够引起从口腔疱疹到威胁视力的角膜炎等多种疾病，甚至与阿尔茨海默病的发生存在关联。HSV-1感染始于病毒颗粒与宿主细胞表面的特异性结合，其中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）尤其是3-O-磺酸化的硫酸乙酰肝素，被确认为病毒吸附的关键分子。然而，调控这一关键修饰的分子开关及其在病毒感染中的作用机制尚不完全清楚。

RNA结合蛋白PTBP1（多聚嘧啶区结合蛋白1），也称为异质核核糖核蛋白I（hnRNP I），是基因表达的重要调控因子，主要通过剪接调节发挥作用。尽管PTBP1在细胞分化、发育等多种生物学过程中扮演重要角色，但其在病毒感染特别是HSV-1感染中的功能仍属未知领域。更为有趣的是，负责催化硫酸乙酰肝素3-O-磺酸化修饰的HS3ST3A1和HS3ST3B1基因，其前体mRNA均包含异常长的内含子（分别为103.7 kb和43.0 kb），这提示它们可能依赖于特殊的剪接调控机制。这些科学问题促使南京大学的研究团队开展了深入探索。

为了回答这些问题，研究人员在《Cell & Bioscience》上发表了他们的最新发现。他们采用多种关键技术方法开展研究，包括利用CRISPR/Cas9技术构建PTBP1和HS3ST3A1基因敲除细胞系，通过RNA测序（RNA-seq）分析全基因组转录变化，运用RNA免疫共沉淀（RIP）验证PTBP1与靶基因RNA的直接相互作用，并建立小鼠疱疹性角膜炎（HSK）模型评估agomiR-124的治疗效果。

PTBP1基因敲除导致HS3ST3A1和HS3ST3B1表达缺失

研究人员首先通过CRISPR/Cas9技术成功构建了PTBP1基因敲除（ko）的HeLa细胞系，并通过免疫印迹验证了PTBP1蛋白的缺失。RNA-seq分析显示，PTBP1敲除导致993个基因显著上调，683个基因下调。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析表明，这些差异表达基因主要富集于蛋白聚糖加工、MAPK信号通路和硫酸乙酰肝素修饰等通路。特别值得注意的是，HS3ST3A1和HS3ST3B1的表达在PTBP1敲除细胞中几乎完全消失，而其他硫酸乙酰肝素生物合成相关基因及其他3OST家族成员未受显著影响。

PTBP1缺失通过影响HSV-1附着使细胞对感染产生抵抗

由于HSV-1利用3-O-磺酸化硫酸乙酰肝素进行细胞附着，研究人员推测PTBP1敲除导致的HS3ST3A1/B1表达缺失会影响病毒感染。病毒结合实验证实，与亲本细胞相比，PTBP1敲除细胞表面结合的HSV-1病毒颗粒显著减少。感染实验进一步表明，PTBP1敲除细胞中HSV-1感染性细胞蛋白（ICP0和ICP27）的表达和病毒滴度均大幅下降（降低约3个数量级）。通过在外源重新表达PTBP1，可以恢复细胞对HSV-1的易感性，证明PTBP1对病毒感染是必需的。

PTBP1通过调控HS3ST3A1/B1前体mRNA剪接介导其表达

机制探索表明，PTBP1直接结合HS3ST3A1和HS3ST3B1前体mRNA的长内含子区域。RNA免疫共沉淀（RIP）实验验证了这一特异性相互作用。RT-PCR分析发现，PTBP1敲除细胞中虽然能检测到HS3ST3A1/B1的各个外显子，但无法检测到跨越两个外显子的成熟mRNA，表明内含子剪接受阻。细胞核质分离实验显示，PTBP1敲除细胞核内前体mRNA积累，而胞质中成熟mRNA减少，进一步证实剪接缺陷。研究人员还构建了PTBP1二聚化缺陷突变体（C23S），发现其无法恢复HS3ST3A1/B1的表达和HSV-1感染，说明PTBP1的二聚化对其剪接调控功能至关重要。

靶向PTBP1的agomiR-124缓解小鼠疱疹性角膜炎

基于上述发现，研究人员探索了靶向PTBP1的治疗潜力。他们选用已知能抑制PTBP1表达的miR-124-3p，并开发了其激动剂agomiR-124用于体内研究。小鼠角膜基质内注射agomiR-124可显著降低局部PTBP1和HS3ST3A1的表达。在HSV-1角膜感染模型中，agomiR-124处理组小鼠的泪液病毒脱落量和三叉神经节内的病毒基因组DNA拷贝数均显著低于对照组，其效果与抗病毒药物阿昔洛韦（ACV）相当，表明抑制PTBP1表达能有效缓解疱疹性角膜炎。

研究结论与意义

本研究首次揭示了PTBP1作为关键宿主因子，通过调控HS3ST3A1和HS3ST3B1基因的长内含子剪接，影响硫酸乙酰肝素的3-O-磺酸化修饰，进而介导HSV-1的细胞附着和感染。该发现不仅深化了对病毒-宿主相互作用的理解，更重要的是，提出了通过调控RNA剪接过程进行抗病毒治疗的新策略。靶向PTBP1的agomiR-124在动物模型中的成功应用，为开发治疗HSV-1感染及相关疾病（如疱疹性角膜炎）的新型疗法提供了有前景的候选方案。由于多种病原体利用硫酸乙酰肝素作为受体，该研究发现的机制可能具有更广泛的抗病毒意义。