连接纤毛、应激反应与蛋白质稳态异常：RPGRIP1视网膜类器官的变异评估与治疗策略新视角

《Stem Cell Reports》：Connecting cilium, stress response, and proteostasis abnormalities inform variant and therapy assessment in RPGRIP1 retinal organoids

本研究针对RPGRIP1相关遗传性视网膜疾病（IRD）中近半数变异为临床意义未明（VUS）的难题，利用患者来源及CRISPR-Cas9基因编辑的iPSC视网膜类器官模型，系统揭示了RPGRIP1变异通过破坏连接纤毛（CC）互作组、引发应激反应与蛋白质稳态异常导致光感受器功能障碍。研究首次证实错义VUS c.2108T>C p.(Ile703Thr)的致病性，并通过AAV介导的基因增强疗法成功挽救疾病表型，为VUS重分类及基因治疗评估提供了新型生物标志物体系。

　　

在遗传性视网膜疾病（IRD）的庞大谱系中，莱伯先天性黑蒙（LCA）是一类在婴幼儿期即导致严重视力损伤的罕见病，其中RPGRIP1基因突变约占5%-7%。RPGRIP1编码的蛋白质位于光感受器连接纤毛（CC），如同一座精密桥梁，连接着负责蛋白质合成的内节（IS）与执行光转换功能的外节（OS）。当RPGRIP1功能失常，蛋白质运输受阻，光感受器逐渐退化，患者最终陷入黑暗。

然而，临床诊断面临巨大挑战：在ClinVar数据库中，近一半RPGRIP1变异被归类为“临床意义未明”（VUS），尤其是占VUS84%的错义变异（MS），因其难以通过传统手段评估致病性，阻碍了患者获得精准诊断和参与基因治疗临床试验的机会。尽管小鼠模型为RPGRIP1功能研究提供了基础线索，但其对人类特异性氨基酸变化的模拟能力有限。如何突破瓶颈，建立更贴近人类疾病的多维评价体系，成为领域内亟待解决的关键问题。

为此，研究团队将目光投向人诱导多能干细胞（iPSC）分化的视网膜类器官。这一三维模型能高度模拟人视网膜发育与病理特征，为在体外“重现”疾病、解析机制提供了理想平台。

关键技术方法

研究依托患者来源（LCA-1、LCA-2）及CRISPR-Cas9基因编辑构建的iP系，通过2D-3D分化体系获得视网膜类器官；利用牛津纳米孔长读长测序进行变异相位分析；结合免疫荧光、超分辨率显微成像、蛋白质印迹评估细胞结构与蛋白定位；采用转录组测序（RNA-seq）、单细胞RNA-seq挖掘分子网络；并通过AAV2-GRK1-RPGRIP1载体进行基因治疗验证。

研究结果

RPGRIP1异常破坏连接纤毛蛋白质互作网络

在对照组类器官中，RPGRIP1定位于根蛋白（rootletin）标记的纤毛根部远端，而与RPGRIP1功能相关的RPGR和CEP290紧密共定位。然而，在LCA-1（纯合无义变异）、LCA-2（复合杂合：致病性移码变异+VUS c.2108T>C）及基因编辑的MS-VUS（纯合c.2108T>C）类器官中，RPGRIP1表达显著降低或错误定位至细胞核，且RPGR与CEP290的空间共定位面积减少超50%，表明CC蛋白质复合体组装受损。

光感受器蛋白运输障碍是核心表型

视紫红质（rhodopsin）和L/M-视蛋白在变异类器官的OS中信号减弱，并错误累积于IS及外核层（ONL），而S-视蛋白运输未受影响。外周蛋白2（PRPH2）在OS的表达量也显著降低，进一步证实RPGRIP1缺陷破坏了光感受器盘膜结构与蛋白定向运输。

转录组特征揭示应激反应与蛋白质稳态失调

基因集富集分析显示，变异类器官中光感受器功能相关通路被抑制，而应激反应（如EDNRB、SALL1、STAT3）与蛋白质稳态相关基因（如CRYAA、CRYAB）上调。单细胞RNA-seq进一步发现，变异类器官中Rod-2亚群比例升高，该群体高表达氧化应激、自噬等通路基因，提示其可能为疾病相关敏感细胞亚群。

错义VUS通过蛋白质错误折叠加剧细胞应激

MS-VUS类器官虽能表达全长RPGRIP1蛋白，但PROTEOSTAT染色显示其蛋白聚集现象较对照组增强3-4倍，且CRYAA/CRYAB表达显著上调，表明Ile703Thr变异导致蛋白质构象不稳定，引发异常聚集与细胞应激反应。

基因治疗有效逆转疾病表型

AAV介导的RPGRIP1基因增强疗法使LCA-1类器官的RPGRIP1重新定位于CC，视紫红质运输效率提升，cGMP在光感受器胞体的异常累积减少，应激基因表达回落，证实治疗可多维度逆转病理表型。

结论与展望

本研究通过视网膜类器官模型，构建了涵盖细胞结构、分子网络及应激响应的RPGRIP1疾病生物标志物体系，不仅为错义VUS c.2108T>C的致病性提供了关键证据，还验证了基因治疗的可行性。该策略突破了传统VUS解析的局限，为大量未明确变异的功能验证与治疗开发提供了可推广的框架。未来，结合高通量基因编辑与自动化类器官平台，有望实现RPGRIP1及其他IRD基因的规模化VUS解读，加速精准医疗时代的到来。