工程化染色质阅读器MCPH1-BRCT实时追踪活细胞和动物体内DNA损伤动力学

《Nature Communications》：Engineered chromatin readers track damaged chromatin dynamics in live cells and animals

本研究针对活体DNA损伤动态监测工具缺乏的难题，开发了基于MCPH1串联BRCT结构域的工程化染色质阅读器(eCR)。该探针可特异性识别DNA双链断裂标志物γH2AX，实现活细胞/动物体内损伤动力学的实时可视化，为DNA修复研究及临床诊断提供新型工具。

　　

基因组稳定性是维持生命活动的基础，然而内源性和外源性因素不断引发DNA损伤，其中双链断裂(DSBs)是最具破坏性的损伤类型之一。细胞通过激活DNA损伤应答(DDR)信号通路，招募修复蛋白至损伤位点。在这个过程中，组蛋白H2AX的C端尾部会发生磷酸化，形成γH2AX，它作为信号平台引导修复因子的时空招募。尽管γH2AX是DNA损伤的重要标志物，但现有检测方法主要依赖固定细胞抗体染色，无法实现活体动态监测，这严重限制了我们对DNA修复动力学的理解。

为了解决这一技术瓶颈，乌得勒支大学的研究团队在《Nature Communications》发表了创新性研究成果。他们开发了一种工程化染色质阅读器(eCR)，能够特异性识别γH2AX并实时追踪DNA损伤动态。这种新型探针为DNA损伤研究提供了强大的工具，有望推动基础研究和临床应用的发展。

研究人员主要运用了以下关键技术：通过重组酶介导的盒式交换(RMCE)在细胞基因组特定位点稳定表达eGFP标记的BRCT结构域；利用活细胞时间推移显微成像分析DNA损伤焦点形成动力学；采用荧光漂白恢复(FRAP)技术评估探针与染色质的结合动力学；通过CRISPR/Cas9系统在特定基因组位点诱导DNA损伤；应用染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)进行全基因组DNA损伤位点图谱分析。

Generation and selection of engineered DNA damage sensors specific for γH2AX

研究人员首先筛选了49个小鼠BRCT结构域，最终选择7个已知与DDR相关的串联BRCT结构域进行测试。通过稳定表达eGFP融合的工程化染色质阅读器(eCRs)，发现MCPH1的串联BRCT结构域(BRCT2-3)在多种基因毒性条件下均能形成清晰的核焦点，并与γH2AX位点高度共定位，显示出对DNA损伤位点的特异亲和力。

Functional evaluation of MCPH1-BRCT-eCR interactions with γH2AX

实验证实MCPH1-BRCT-eGFP的定位完全依赖于γH2AX的存在和磷酸化。ATM激酶抑制剂处理显著减少探针焦点形成，而点突变实验显示单个BRCT结构域不足以有效招募至损伤位点，表明串联BRCT结构对γH2AX识别至关重要。在H2AX缺陷型RPE-1细胞中，探针完全丧失损伤位点识别能力。

Expression of MCPH1-BRCT-eGFP is compatible with endogenous DSB formation in living cells

表达MCPH1-BRCT-eCR的细胞在DNA修复因子(53BP1、RAD51)招募、细胞周期进程和克隆形成能力方面与对照无显著差异，证明该探针不干扰内源性DNA修复过程。持续监测显示探针能准确反映γH2AX动态变化，验证其作为中性报告工具的可靠性。

MCPH1-BRCT-eCR is dynamically recruited to γH2AX sites and tracks DNA damage kinetics in living cells and animals

时间推移显微技术揭示探针在DNA损伤后15分钟内即可检测到焦点形成，在不同细胞系中呈现特征性动力学曲线。特别值得注意的是，在线虫模型中成功监测到减数分裂程序性DSBs，证明其在活体动物中的应用潜力。

MCPH1-BRCT eCR allows visualization and genome-wide detection of targeted DNA damage sites

通过CRISPR/Cas9系统在特定基因组位点（包括异染色质区的主要卫星重复序列）诱导DSBs，探针均能有效识别。在DIvA细胞系中，ChIP-seq分析显示探针与已知BLESS定义的DSBs位点高度一致，证实其在全基因组水平检测DNA损伤的能力。

该研究开发的MCPH1-BRCT-eCR探针突破了现有DNA损伤检测技术的局限，首次实现了在活细胞和动物体内对γH2AX动态过程的实时、无创监测。其独特的优势在于利用天然BRCT阅读器结构域与染色质的生理性相互作用，相比纳米抗体等人工探针具有更快的定位动力学和更低的干扰性。该工具不仅适用于基础DNA修复机制研究，在临床诊断、药物筛选和放射治疗监测等领域同样具有广阔应用前景，为理解基因组稳定性维持机制提供了强大技术平台。