使用BreakTag对基因组编辑核酸酶活性进行多级表征

《Nature Protocols》：Multilevel characterization of genome editor nuclease activity with BreakTag

CRISPR可编程核酸酶及向导RNA的多维度分析技术，包含非靶向位点提名、酶活性评估及切割模式解析，支持Cas变体工程优化。采用Cas9向导RNA递送切割基因组DNA，富集平齐/阶梯状双链断裂，结合NGS测序与BreakInspectoR数据分析平台，实现高效高通量表征。配套工具XGScission机器学习模型可预测未知序列切割偏好，HiPlex技术实现千级sgRNA并行制备。全流程仅需3天完成，包含6小时文库构建、测序及分析。

　　

摘要

BreakTag是一种可扩展的下一代测序方法，用于在多个层面上无偏地表征可编程核酸酶和引导RNA。该方法能够识别脱靶位点、评估核酸酶的活性，并分析切割模式。在基于Cas9的基因编辑中，切割模式与插入/缺失修复的结果存在机械性关联。该过程依赖于Cas9和引导RNA（以核糖核蛋白形式存在）对基因组DNA的切割，随后富集由CRISPR核酸酶在靶标和非靶标序列上产生的平末端和交错双链断裂。通过下一代测序和BreakInspectoR数据分析，可以高效地表征Cas核酸酶的活性、特异性、原间隔区相邻基序的频率以及切割模式。首先，我们详细描述了用于识别CRISPR脱靶位点和多层面表征工程化Cas变体的BreakTag方案；其次，我们提供了使用BreakInspectoR进行数据分析和处理的逐步指南；最后，我们介绍了XGScission这一机器学习模型，该模型可以利用BreakTag数据预测模型未见过的新型序列中的平末端和交错双链断裂的相对频率。XGScission能够预先筛选出预计会以交错方式被切割的目标序列，并优先将这些序列修复为单核苷酸模板插入。此外，XGScission还可用于分析SpCas9及工程化核酸酶变体进行平末端和交错切割的序列决定因素。作为补充策略，我们还介绍了HiPlex技术，该技术可用于批量生成数百至数千条单条引导RNA，从而构建可靠的BreakTag数据集。BreakTag文库的制备耗时约6小时，整个流程（包括测序、BreakInspectoR数据分析以及XGScission模型训练）可在约3天内完成。