内在的NPRL2和NPRL3蛋白调控B细胞恶性肿瘤对CAR-T细胞治疗的敏感性

《Journal of Genetics and Genomics》：Intrinsic NPRL2 and NPRL3 regulate the sensitivity of B-cell malignancies to CAR-T cell therapy

通过CRISPR/Cas9基因组筛查发现NPRL2/NPRL3抑制mTORC1信号通路，导致肿瘤细胞与CAR-T细胞结合减少、激活障碍及 exhaustion增加，从而抵抗CAR-T细胞毒性。基因敲除或激活mTORC1可逆转此现象，体内实验证实靶向该通路可增强CAR-T疗效。分隔符：

　　在癌症免疫治疗领域，CAR-T细胞疗法已成为治疗B细胞恶性肿瘤的重要手段之一。这种疗法通过将患者的T细胞进行基因工程改造，使其表达能够特异性识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体（CAR），从而增强其对癌细胞的杀伤能力。然而，尽管CAR-T疗法在临床中取得了显著成果，但仍存在部分患者对治疗反应不佳或出现耐药性，这限制了其在更广泛人群中的应用。因此，理解肿瘤细胞对CAR-T疗法产生抵抗的内在机制，对于提高治疗效果和克服耐药性至关重要。

本研究通过结合CRISPR/Cas9全基因组筛选技术与临床数据，揭示了NPRL2和NPRL3在调控肿瘤细胞对CAR-T细胞毒性反应中的关键作用。研究团队在B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）细胞系Nalm6中进行了全基因组敲除筛选，发现NPRL2和NPRL3的缺失能够显著增强肿瘤细胞对CAR-T细胞的敏感性。进一步的临床数据分析表明，在接受双靶点CD19/CD20 CAR-T细胞治疗的复发/难治性（R/R）B细胞淋巴瘤患者中，肿瘤细胞中NPRL2和NPRL3的高表达与治疗耐药性密切相关。此外，体外实验也验证了这一点，即当肿瘤细胞过表达NPRL2或NPRL3时，其对CAR-T细胞介导的细胞毒性表现出更高的抗性。

NPRL2和NPRL3属于同源结构域蛋白家族，它们在细胞内的功能主要与mTORC1信号通路相关。mTORC1是调控细胞生长、增殖和代谢的核心蛋白，其活性受到多种机制的调控，包括营养感应和细胞信号传导。NPRL2和NPRL3通过与DEPDC5形成GATOR1复合物，抑制mTORC1的活性，从而影响肿瘤细胞对免疫细胞攻击的反应。研究发现，NPRL2和NPRL3的高表达能够显著降低mTORC1的活性，进而抑制CAR-T细胞的激活和杀伤功能。这种抑制作用不仅影响肿瘤细胞与CAR-T细胞之间的结合效率，还影响CAR-T细胞的增殖能力和细胞因子分泌水平，最终导致肿瘤细胞的免疫逃逸。

为了进一步验证这一机制，研究团队采用了两种策略：一是通过基因编辑手段敲除NPRL2和NPRL3，二是使用mTORC1激活剂MHY1485进行药理学干预。结果显示，无论是基因敲除还是药物激活，均能有效提高CAR-T细胞的活性和杀伤能力。基因敲除实验表明，NPRL2和NPRL3的缺失使肿瘤细胞对CAR-T细胞的杀伤更加敏感，而mTORC1的激活则显著增强了CAR-T细胞的杀伤效果。这些发现不仅揭示了NPRL2和NPRL3在肿瘤细胞对CAR-T治疗反应中的核心作用，还为开发新的联合治疗策略提供了理论依据。

在动物模型中，研究团队进一步验证了这些发现。通过将Nalm6细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，并分别给予NPRL3敲除或mTORC1激活的处理，观察到肿瘤细胞的清除效率显著提高。此外，CAR-T细胞在体内的扩增和功能状态也得到了改善，表现为更高的激活水平和更低的耗竭标志物表达。这些结果表明，针对肿瘤细胞中的NPRL2/NPRL3或直接激活mTORC1信号通路，可以作为增强CAR-T治疗效果的潜在策略。

研究还探讨了NPRL2和NPRL3在不同癌症类型中的功能差异。例如，在乳腺癌、小细胞肺癌和肾癌中，NPRL2被鉴定为可能的抑癌基因，其表达能够抑制肿瘤进展。然而，在膀胱癌和前列腺癌中，NPRL2却表现出促癌特性，这表明其功能可能因肿瘤类型而异。NPRL3在多种癌症中也表现出类似的双重作用，既有抑制肿瘤生长的潜力，也可能促进某些类型的肿瘤发生。因此，NPRL2和NPRL3的功能可能需要在特定的肿瘤微环境中进行评估，以确定其对免疫治疗的响应机制。

此外，研究团队还分析了CAR-T细胞在肿瘤细胞中NPRL2/NPRL3过表达情况下的功能变化。结果显示，NPRL2/NPRL3的过表达显著降低了CAR-T细胞的激活和增殖能力，并减少了其分泌的促炎性细胞因子，如IFNγ、TNFα和IL-2。这些细胞因子在CAR-T细胞的抗肿瘤效应中起着至关重要的作用，因此它们的减少可能导致CAR-T细胞功能受损。相反，当NPRL2/NPRL3被敲除或mTORC1被激活时，CAR-T细胞的激活水平显著提高，细胞因子分泌量也随之增加，从而增强了其对肿瘤细胞的杀伤能力。

值得注意的是，NPRL2和NPRL3不仅影响肿瘤细胞对CAR-T细胞的敏感性，还可能通过影响肿瘤细胞的代谢和免疫应答能力，间接调控CAR-T细胞的功能。例如，NPRL2/NPRL3的过表达会改变肿瘤细胞的代谢状态，使其处于低代谢状态，这可能削弱CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。而mTORC1的激活则能够恢复肿瘤细胞的代谢活性，使其更容易被CAR-T细胞识别并清除。因此，NPRL2/NPRL3与mTORC1之间的相互作用可能在肿瘤细胞的免疫逃逸和CAR-T细胞的治疗效果中起到关键作用。

本研究的发现为CAR-T细胞疗法的优化提供了新的思路。通过靶向肿瘤细胞中的NPRL2/NPRL3或直接激活mTORC1信号通路，可以有效提高CAR-T细胞的治疗效果，并克服部分患者的治疗耐药性。这不仅拓宽了CAR-T细胞疗法的应用范围，还为个性化治疗策略的制定提供了科学依据。例如，在NPRL2/NPRL3高表达的肿瘤患者中，可以考虑联合使用mTORC1激活剂以增强治疗效果。此外，研究还指出，尽管NPRL2和NPRL3在某些癌症中可能具有促癌作用，但在CAR-T细胞治疗的背景下，它们的表达可能更倾向于抑制治疗效果，因此需要进一步研究其在不同癌症类型中的具体作用机制。

研究团队在实验方法上采用了多种技术手段，包括CRISPR/Cas9全基因组筛选、体外和体内功能验证、免疫组化分析以及RNA测序等。这些方法的结合不仅提高了研究的可靠性，还为理解肿瘤细胞对免疫治疗的反应机制提供了全面的视角。例如，通过RNA测序，研究人员能够识别出NPRL2/NPRL3过表达后，肿瘤细胞中哪些基因的表达发生了显著变化，从而进一步揭示其对免疫应答的影响。同时，免疫组化分析则帮助确认了NPRL2和NPRL3在肿瘤组织中的表达情况，为临床应用提供了直观的证据支持。

在数据处理和统计分析方面，研究团队采用了严格的统计学方法，包括t检验、Mann-Whitney U检验以及ANOVA等，以确保实验结果的准确性和可靠性。所有实验数据均以均值加减标准差的形式呈现，并对显著性进行了量化评估。这种严谨的数据分析方法为研究结论提供了有力的支持，并确保了实验结果的可重复性和可推广性。

综上所述，本研究揭示了NPRL2和NPRL3在调控肿瘤细胞对CAR-T细胞治疗反应中的关键作用。通过靶向这些基因或激活mTORC1信号通路，可以有效提高CAR-T细胞的治疗效果，克服部分患者的耐药性问题。这些发现不仅深化了我们对CAR-T细胞疗法机制的理解，还为未来开发更高效的免疫治疗策略提供了重要的理论基础。随着对NPRL2/NPRL3与mTORC1信号通路之间相互作用的进一步研究，有望在临床中实现更精准的治疗方案，从而提高CAR-T细胞疗法的疗效和适用范围。