利用eVLP介导的Cas9递送技术预防胰岛移植中的免疫排斥反应（IBMIR）

《Small》：eVLP-Mediated Cas9 Delivery for Preventing IBMIR in Islet Transplantation

胰岛移植中即时血液介导的炎症反应（IBMIR）导致移植失败，本研究利用 engineered virus-like particles (eVLP)-mediated CRISPR/Cas9系统敲除 rat islets 中的 TF 和 PAI-1 基因，有效抑制 IBMIR，使移植胰岛存活率显著提高，血糖控制改善，且未发现明显脱靶效应。

　　在当前医学研究中，胰岛移植作为一种有效的β细胞替代疗法，已被广泛应用于治疗1型糖尿病（T1DM）的临床实践。然而，这一疗法的成功率长期受到“即时血介导的炎症反应”（IBMIR）的严重限制。IBMIR是移植过程中，胰岛细胞与血液接触后迅速引发的一系列炎症反应，包括凝血级联反应、补体系统激活以及先天免疫应答，最终导致胰岛移植物的快速丧失。这种反应的发生机制涉及多个关键分子，其中组织因子（Tissue Factor, TF）和纤溶酶原激活物抑制剂-1（Plasminogen Activator Inhibitor-1, PAI-1）被认为是IBMIR的核心驱动因子。TF是凝血反应的启动者，其在胰岛表面的表达会触发凝血级联反应，进而导致血栓形成和炎症反应的加剧。而PAI-1则通过抑制纤溶酶活性，使得纤维蛋白沉积在移植物周围，进一步促进凝血和炎症反应的持续发生。因此，调控TF和PAI-1的表达水平，被认为是一种有效抑制IBMIR、提高胰岛存活率的潜在策略。

为了实现这一目标，研究人员采用了基因编辑技术，特别是基于CRISPR/Cas9的系统。CRISPR/Cas9是一种源自细菌的基因编辑工具，通过单链引导RNA（gRNA）的引导，Cas9核酸酶可以精确地切割目标基因，进而通过细胞自身的修复机制引入特定的插入或缺失（indels）。然而，传统的基因编辑方法在应用于胰岛细胞时面临诸多挑战。胰岛细胞具有三维聚集体结构和静止表型，这使得常规的递送方式如病毒载体、电穿孔和脂质体转染等，不仅效率有限，还可能引发细胞毒性、免疫反应或脱靶效应等问题。为了解决这些问题，研究团队开发了一种新型的递送系统——工程化的病毒样颗粒（engineered virus-like particles, eVLPs）。eVLPs是一种人工合成的非病毒载体，具有与病毒相似的结构但不含病毒遗传物质，因此避免了病毒载体可能带来的整合风险和免疫反应。此外，eVLPs可以将Cas9核酸酶与gRNA以核糖核蛋白（RNP）的形式直接递送到目标细胞，从而减少Cas9的长期表达，降低脱靶效应的可能性。

本研究中，研究人员利用eVLP递送的CRISPR/Cas9系统，对大鼠胰岛中的TF和PAI-1基因进行了靶向敲除。首先，通过在PC12细胞中筛选不同的gRNA，确定了能够有效靶向TF和PAI-1的最适配序列。随后，研究人员在大鼠胰岛细胞中测试了不同剂量的Cas9-eVLPs递送效果，最终选择了能够实现高编辑效率同时保持细胞活力的剂量组合。实验结果显示，在最优剂量下，TF基因的编辑效率为18.09% ± 0.52%，PAI-1基因的编辑效率为22.46% ± 2.25%。此外，通过靶向深度测序技术，研究人员进一步验证了编辑的特异性，发现TF和PAI-1的靶向编辑在预期的脱靶位点并未引起显著的突变，表明该方法具有较高的精准性和安全性。

为了评估基因编辑对胰岛细胞功能的影响，研究团队对编辑后的胰岛进行了细胞活力和功能检测。结果表明，经过eVLP递送的Cas9处理后，胰岛细胞的活力未受到明显影响，且在葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验中，其胰岛素分泌能力与未经处理的胰岛相当。这说明基因编辑并未损害胰岛细胞的基本功能，为后续的体内实验奠定了基础。在体内实验中，研究人员将经过TF和PAI-1基因敲除的胰岛移植到STZ诱导的糖尿病小鼠模型中，并观察其对血糖控制和移植物存活率的影响。结果显示，接受基因敲除胰岛的小鼠在移植后30天内保持了稳定的血糖水平，而对照组小鼠则表现出持续的高血糖状态。此外，移植后的基因敲除胰岛存活率显著高于对照组，说明TF和PAI-1的抑制有效缓解了IBMIR对胰岛的损害。

为了进一步验证基因敲除对IBMIR相关指标的影响，研究人员检测了移植后小鼠血浆中的凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）和补体成分3a（C3a）的水平。TAT和C3a是IBMIR发生过程中产生的关键生物标志物，它们的浓度变化可以反映凝血和补体系统的激活程度。结果显示，接受TF或PAI-1基因敲除胰岛的小鼠在移植后第3天和第10天，TAT和C3a的水平显著低于对照组。这表明，通过基因编辑手段降低TF和PAI-1的表达，有效抑制了凝血和补体系统的激活，从而减轻了IBMIR的炎症反应。同时，组织学分析也支持这些发现，接受基因敲除胰岛的小鼠肝脏组织中，胰岛的结构保持完整，且胰岛素表达水平显著提高，而对照组小鼠的胰岛则表现出明显的萎缩和结构破坏。

尽管本研究取得了令人鼓舞的成果，但仍存在一些需要进一步探讨的问题。首先，实验是在免疫缺陷的小鼠模型中进行的，而人类的免疫系统更为复杂，因此需要在免疫功能完整的模型中验证该策略的有效性。其次，尽管eVLP递送系统具有较低的毒性和较高的编辑效率，但其在大规模生产中的可行性和安全性仍需进一步优化，以满足临床转化的需求。此外，长期的基因编辑对胰岛功能的影响也需要进一步研究，以确保其在人体中的稳定性和持久性。最后，未来的研究还可以探索将该策略与其他免疫调节手段相结合，以进一步提高胰岛移植的成功率。

总的来说，本研究展示了eVLP递送的CRISPR/Cas9系统在胰岛基因编辑中的应用潜力。通过靶向敲除TF和PAI-1，研究人员成功抑制了IBMIR的发生，显著提高了胰岛的存活率和功能。这一方法不仅避免了传统基因编辑手段可能带来的细胞毒性、免疫反应和脱靶效应，还为胰岛移植提供了新的治疗思路。随着基因编辑技术的不断进步和递送系统的优化，未来有望将该策略应用于临床，为1型糖尿病患者提供更加安全和有效的治疗方案。然而，从实验室研究到临床应用，仍然需要克服一系列技术和监管挑战，包括大规模生产、长期安全性评估以及免疫系统对编辑后胰岛的反应等。只有在这些方面取得突破，才能真正实现该技术的临床转化和广泛应用。