整合转录组学和磷酸蛋白质组学分析揭示了水稻中SnRK1信号网络的关键组成部分

《Plant Direct》：Integrative Transcriptomic and Phosphoproteomic Analysis Reveals Key Components of the SnRK1 Signaling Network in Rice

水稻SnRK1信号网络功能解析：通过CRISPR/Cas9构建snrk1突变体，结合表型、转录组、蛋白质组和磷酸蛋白质组分析，揭示SnRK1在能量充足与饥饿条件下调控生长、代谢及抗病性的双重作用，并鉴定亚功能分化及新型磷酸化靶点。

　　SnRK1蛋白激酶在植物中扮演着至关重要的角色，它属于进化上保守的SNF1/AMPK蛋白激酶家族，主要负责根据能量状态协调植物的生长与细胞代谢。SnRK1在饥饿和其他应激条件下被激活，通过磷酸化其靶蛋白，调节植物的代谢和生理活动。在水稻中，SnRK1的三个功能性激酶α亚基基因OsSnRK1αA、OsSnRK1αB和OsSnRK1αC，分别对应Os05g0530500/LOC_Os05g45420、Os03g0289100/LOC_Os03g17980和Os8g0484600/LOC_Os08g37800。研究发现，OsSnRK1αB和OsSnRK1αC在序列上具有较高的同源性（88.2%基因组序列和98.02%蛋白序列），而OsSnRK1αA则更为分化。基于这些特性，研究者通过CRISPR/Cas9技术构建了单突变体snrk1a和双突变体snrk1bc，并选用了日本稻品种Kitaake作为研究对象。这些突变体表现出在正常条件和饥饿条件下生长缺陷，这表明SnRK1在水稻生长和适应性方面具有广泛的作用。

通过表型分析、转录组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学，研究揭示了SnRK1信号通路在调控水稻生长和应激反应中的核心作用。在正常生长条件下，snrk1a和snrk1bc突变体的幼苗表现出较短的长度和较低的生物量，这与野生型（WT）形成鲜明对比。在饥饿条件下，突变体的幼苗更纤细，而生物量减少则在snrk1bc突变体中更为显著。这些表型特征进一步说明SnRK1在水稻幼苗建立和对饥饿的响应中发挥着关键作用。此外，突变体对水稻稻瘟病（由Magnaporthe oryzae引起）表现出更高的易感性，这表明SnRK1信号通路在植物防御反应中也起着重要作用。

研究进一步探讨了SnRK1在能量充足状态下的调控作用。通过RNA-seq分析，研究者发现snrk1a和snrk1bc突变体在正常条件下的基因表达发生了显著变化。其中，snrk1bc突变体的基因表达变化更为显著，涉及更多的调控过程。在基因本体（GO）分析中，snrk1a突变体中上调的基因主要与糖酵解、细胞壁形成和细胞周期相关，而snrk1bc突变体则表现出更多的与应激反应和防御机制相关的上调基因。这些结果表明，在能量充足的情况下，SnRK1有助于促进生长相关过程，同时抑制应激相关过程。然而，在snrk1bc突变体中，由于其更严重的生长缺陷，基因表达的紊乱程度更高，这也进一步支持了SnRK1在不同组织中具有不同的功能专化。

在饥饿条件下，研究者通过比较9天龄幼苗的转录组，发现了SnRK1突变体中调控过程的紊乱。WT在饥饿条件下表现出显著的应激反应和分解代谢过程的上调，而这些过程在snrk1a和snrk1bc突变体中则受到不同程度的干扰。例如，snrk1a突变体中只有约386个基因发生了表达变化，而snrk1bc突变体中则有843个基因发生改变。这些结果表明，SnRK1在饥饿响应中具有核心调控作用，并且其功能在不同突变体中表现出不同的特异性。进一步分析显示，snrk1bc突变体中与应激反应和分解代谢相关的基因被显著下调，而与生长相关的基因则被显著上调，这与SnRK1在饥饿条件下促进分解代谢、抑制生长的已知功能相一致。

在磷酸化蛋白质组学分析中，研究者发现snrk1bc突变体中存在一系列与生长、代谢和应激相关的磷酸化位点变化。这些变化表明，SnRK1通过调控特定蛋白的磷酸化，影响其功能状态。例如，SnRK1突变体中一些已知的靶蛋白，如SPS4、eIF4G和Raptor 1等，表现出磷酸化水平的降低，这可能意味着这些蛋白的稳定性或活性受到影响。同时，一些新的靶蛋白，如TRAPPII复合体特异性亚基TRS120和VPS9a，也显示出显著的磷酸化变化，进一步表明SnRK1在调控细胞内膜运输和能量代谢中的重要作用。

研究还揭示了SnRK1在调控葡萄糖代谢和能量生成过程中的关键作用。在饥饿条件下，SnRK1突变体中与葡萄糖代谢和能量生成相关的磷酸化位点发生了显著变化。这些变化包括一些关键酶的磷酸化水平降低，如Fructose-bisphosphate aldolase 1、Sedoheptulose 1,7-bisphosphatase、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1和phosphoglycerate kinase。这些结果表明，SnRK1通过调控这些酶的磷酸化，影响其活性，从而调控能量生成过程。此外，研究还发现一些与细胞分裂和细胞壁合成相关的磷酸化位点在snrk1bc突变体中显著上调，这与SnRK1抑制这些过程的已知功能相矛盾，进一步说明了SnRK1在不同条件下的功能复杂性。

研究还探讨了SnRK1在膜运输中的潜在作用。通过分析磷酸化位点的变化，研究者发现一些关键的膜运输蛋白，如VPS9a和TRS120，其磷酸化水平在snrk1bc突变体中发生了显著变化。这表明SnRK1可能通过调控这些蛋白的磷酸化，影响细胞内的膜运输过程。此外，研究还发现一些与乙烯信号通路相关的磷酸化位点变化，如OsEIN2和OsERF46的下调，这些蛋白在植物发育和应激反应中起着重要作用。这些结果进一步支持了SnRK1在调控植物应激反应和发育过程中的核心作用。

通过分析SnRK1的磷酸化基序，研究者发现SnRK1主要通过磷酸化丝氨酸（Ser）残基来调控其靶蛋白。此外，一些其他基序，如RxxxS和SxxxL，也与SnRK1的磷酸化作用相关。这些基序的发现不仅加深了对SnRK1功能的理解，也为进一步研究其作用机制提供了线索。同时，研究还发现了一些新的基序，如在P-1位点存在丙氨酸（A）的基序，这可能代表了SnRK1调控的新靶点。

总的来说，这项研究通过多种组学技术，揭示了SnRK1在水稻生长和应激反应中的核心作用。研究发现，SnRK1在能量充足和能量不足条件下都发挥着调控作用，既促进生长，又在应激条件下调控适应性反应。此外，研究还发现了一些新的SnRK1靶蛋白，这些蛋白可能在植物的生长和防御中起着重要作用。这些发现不仅加深了对SnRK1功能的理解，也为进一步研究其在其他植物中的作用提供了基础。同时，研究还强调了SnRK1在调控植物代谢和防御反应中的重要性，以及其在不同组织和发育阶段中的功能分化。这些结果对于理解植物如何在不同环境条件下调控生长和防御反应具有重要意义。