METTL3介导m6A修饰调控小鼠胚胎干细胞中转座子与2C样程序诱导的作用机制研究

《Cell Regeneration》：The role of METTL3 in transposable elements regulation and 2C-like program induction in mouse embryonic stem cell

本研究针对METTL3缺失对小鼠胚胎干细胞中转座子（TEs）和2C样基因表达调控机制不明确的问题，通过构建Mettl3基因敲除（KO）模型，结合多组学分析和胚胎嵌合实验，发现METTL3通过m6A酶活性依赖性方式广泛抑制TEs和2C样基因表达，且该作用不依赖培养条件。更重要的是，研究首次通过dTAG瞬时降解系统证明METTL3缺陷的mESCs可贡献于滋养层谱系，揭示了m6A缺失促进2C样程序转变的新机制，为理解表观遗传调控在细胞命运决定中的作用提供了重要依据。

　　

在生命科学的广阔图景中，胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESCs）因其无限自我更新和多向分化的潜能，一直是再生医学和发育生物学研究的焦点。然而，维持这种“多能性”状态的精细调控网络，尤其是表观遗传层面的机制，仍有许多未解之谜。其中，N6-甲基腺苷（m⁶A）作为信使RNA上最丰富的化学修饰之一，由甲基转移酶样蛋白3（METTL3）主导催化，被发现在基因表达调控中扮演关键角色。近年来，研究显示m⁶A修饰与一类特殊的基因组“流浪者”——转座子（Transposable Elements, TEs）的沉默密切相关，而TEs的异常激活又与一种具有更强发育潜能的“2C样状态”（2C-like state）相关联。这种状态模拟了胚胎发育早期2-细胞阶段的特点，细胞甚至能够贡献到胚胎和胚外组织。尽管有研究报道METTL3缺失会影响TEs的表达，但不同实验室的结果存在矛盾，例如在血清培养和无血清培养条件下，LINE1等TEs的表达变化趋势不一致。此外，METTL3缺失是否真能诱导mESCs进入2C样程序，以及这种变化对细胞发育潜能的具体影响，缺乏直接的实验证据。这些问题阻碍了人们对m⁶A修饰在早期胚胎发育和细胞命运决定中功能的深入理解。

为了回答这些科学问题，陈捷凯教授团队在《Cell Regeneration》上发表了他们的最新研究成果。研究人员系统性地探讨了METTL3介导的m⁶A修饰在调控小鼠胚胎干细胞（mESCs）中转座子表达和2C样程序诱导中的作用。

研究团队首先利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，成功构建了Mettl3基因敲除（KO）的mESC系，该策略靶向了包含催化活性中心DPPW模体的外显子4-7，从而有效破坏了METTL3的m⁶A甲基转移酶活性。为了验证不同培养条件对结果的影响，他们分别在含血清（serum+LIF）和无血清（N2B27+2i+LIF）两种经典培养条件下培养野生型（WT）和Mettl3 KO的mESCs。蛋白质印迹（Western blot）和质谱分析均证实，Mettl3 KO细胞中几乎检测不到METTL3蛋白和mRNA上的m⁶A修饰，且这种缺失不受培养条件的影响。

在确认模型有效的基础上，研究人员通过实时定量PCR（RT-qPCR）和RNA测序（RNA-seq）发现，Mettl3 KO导致了包括LINE1和IAP在内的多种TEs的广泛上调表达，这种现象在两种培养条件下均一致出现。为了明确这种上调是否依赖于METTL3的酶活性，他们进行了“拯救”实验，即在Mettl3 KO细胞中分别过表达野生型METTL3（METTL3-WT）、催化位点突变体（METTL3-mut, DPPW→APPA）以及截短体（METTL3-truncated）。结果只有METTL3-WT能够将TEs的表达恢复至野生型水平，而突变体和截短体则无此效果，这强有力地证明了TEs的上调是m⁶A酶活性依赖性的。

除了TEs，研究还发现2C样基因（如Zscan4, Dux等）的表达在Mettl3 KO细胞中也显著上调。基因集富集分析（GSEA）进一步证实了2C相关基因集的富集。同样，过表达实验表明2C样基因的上调也严格依赖于METTL3的m⁶A酶活性。

然而，基因表达的変化是否意味着细胞功能状态的真正转变？为了回答这个核心问题，研究团队设计了一个巧妙的胚胎嵌合实验。他们构建了Mettl3-KI-HA-FKBP knock-in mESC系，并利用dTAGV-1化合物处理实现METTL3蛋白的瞬时降解。将这些处理过的、同时过表达mCherry红色荧光蛋白的mESCs与8细胞期胚胎进行聚集培养，获得E3.5阶段的嵌合胚胎。免疫荧光染色结果显示，在dTAGV-1处理（即METTL3降解）组中，超过70%的嵌合胚胎内，mCherry阳性的mESCs出现在了滋养层谱系中，并与滋养层标志物CDX2共定位，这一比例显著高于DMSO对照组。该实验直接证明了METTL3功能缺陷的mESCs获得了贡献到胚外组织（滋养层）的能力，这是2C样细胞具备扩展发育潜能（extended potency）的关键特征，从而确认了METTL3缺失确实促进了mESCs向2C样程序的转变。

本研究主要应用了以下关键技术方法：利用CRISPR-Cas9基因编辑构建Mettl3敲除细胞系；通过dTAG系统实现METTL3蛋白的快速降解；采用质谱法精确检测mRNA上m⁶A/A比值；运用RNA测序（RNA-seq）和DRB-TT-seq（用于检测新生RNA转录）进行转录组分析；通过胚胎嵌合与免疫荧光染色评估细胞在体内的发育潜能。研究所用小鼠胚胎干细胞来源于129小鼠品系的囊胚内细胞团。

Mettl3 KO leads to widespread upregulation of TEs expression in a m⁶A enzyme activity-dependent manner, regardless culture conditions

研究人员通过构建Mettl3 KO mESC模型，发现在血清和無血清两种培养条件下，TEs（如LINE1, IAP）的RNA表达均被广泛上调。RNA-seq数据验证了这一结果。关键的酶活性拯救实验证明，只有回补野生型METTL3才能逆转TEs的上调，而催化失活突变体无效，表明该调控严格依赖于METTL3的m⁶A甲基转移酶活性，且不受细胞培养环境的影响。

Mettl3 KO also upregulates 2C-like in an m⁶A enzyme activity-dependent manner, regardless culture conditions

研究进一步发现，Mettl3 KO同样导致了2C样基因表达程序的上调。RT-qPCR和GSEA分析显示2C相关基因集在KO细胞中显著富集。与TEs调控类似，过表达实验证实2C样基因的上调也是m⁶A酶活性依赖性的，表明METTL3通过其催化功能共同抑制了TEs和2C样程序。

Embryo chimeric experiments confirm METTL3 deficiency promotes 2C-like program

本研究最关键的发现来自于胚胎嵌合实验。通过dTAG系统瞬时降解METTL3后，将其mESCs注入胚胎，发现在囊胚期，METTL3缺陷的细胞能够整合到滋养层（CDX2阳性）中，这表明它们获得了贡献于胚外组织的潜能，这是2C样状态细胞的典型特征，直接证实了METTL3缺失促进了2C样程序的激活。

综上所述，本研究揭示了METTL3介导的m⁶A修饰是抑制mESCs中TEs转录和2C样程序的关键开关。其作用机制是m⁶A酶活性依赖性的，并且具有培养条件无关的鲁棒性。更重要的是，研究通过严谨的体内功能实验，首次提供了直接证据，证明METTL3的缺失能够赋予mESCs类似全能性的发育潜能。这些发现不仅澄清了此前不同研究组关于METTL3对TEs调控效果的争议，强调了严格验证细胞模型的重要性，更重要的是，它将m⁶A修饰、TEs沉默、异染色质维持以及细胞命运可塑性紧密联系在一起。论文在讨论部分指出，虽然TEs激活常与2C样程序相伴发生，但并非所有TEs（如LINE1, IAP）的激活都足以诱导该程序，暗示可能存在更特异性的调控元件（如MERVL）或下游通路。该研究为理解表观转录组学（Epitranscriptomics）如何通过调控基因组中的“暗物质”TEs来影响细胞命运决定和早期胚胎发育提供了新的范式，对干细胞生物学、再生医学以及相关发育性疾病的研究具有重要意义。