BRC1B上游的保守区域调控番茄花芽的休眠状态

《Frontiers in Plant Science》：Conserved regions upstream of BRC1B regulate bud dormancy in tomato

植物架构主要由腋生分生组织的发育调控，其中TCP类转录因子BRANCHED1（BRC1）通过抑制腋芽生长维持休眠状态。本研究以番茄SlBRC1B为对象，通过比较基因组学鉴定出其上游四个高度保守区域（CR1-CR4），并利用CRISPR/Cas9技术构建突变体。实验表明CR突变显著抑制腋芽生长，其中CR4突变体对分生组织发育影响最显著。酵母双杂交筛选出GRF、MYB、NAC、MADS及锌指蛋白等转录因子可能通过结合CR4调控SlBRC1B表达。本研究揭示了SlBRC1B上游保守区域在腋芽发育中的关键作用，为调控植物分枝提供新靶点。

　　植物的形态结构在很大程度上受到侧枝形成的影响，而侧枝的发育则依赖于腋生芽的形成与生长。腋生芽最初由分生组织发育而来，随后形成叶片原基，最终发展为可见的侧枝。这些芽通常处于休眠状态，直到内部或外部信号促使它们开始生长。休眠状态的维持与顶端优势密切相关，移除顶端（称为去顶）可以打破这种优势，从而引发腋生芽的生长。从休眠到活跃的转变是一个高度保守的发育过程，通过多种内部和外部信号汇聚于一个依赖于BRANCHED1（BRC1）的调控通路实现（Aguilar-Martínez等，2007；Choi等，2012；Finlayson，2007；González-Grandío等，2013；Studer等，2011）。因此，BRC1在整合各种信号以促进腋生芽生长方面起着关键作用。

在许多植物中，BRC1的表达具有高度特异性，主要集中在腋生芽中，抑制其生长（Rameau等，2015；Wang等，2019）。在玉米中，BRC1的同源基因TEOSINTE BRANCHED 1（TB1）因在表达水平上高于其野生近缘种（teosinte）而被首次发现。这种表达的增强减少了从基部节点产生的侧枝，并改变了生殖分生组织中雌花向雄花的发育方向（Clark等，2006；Doebley等，1995；Stitzer和Ross-Ibarra，2018）。而在玉米和水稻中敲除TB1基因（ZmTB1和OsTB1）则导致侧枝增加（Choi等，2012；Studer等，2011）。同样，在双子叶植物中，如拟南芥的BRC1敲除突变体也表现出从叶片腋部增加侧枝生长的现象（Aguilar-Martínez等，2007）。在番茄中，SlBRC1B基因的敲低导致基部节点的腋生芽长度增加，以及发育中的腋生芽总数上升（Martín-Trillo等，2011；Dong等，2023）。与这些发现一致，基部芽显示出最显著的SlBRC1B表达（Martín-Trillo等，2011）。这些结果突显了BRC1作为腋生芽生长抑制因子的功能。

转录调控是通过直接结合到基因位点内的调控序列（称为cis调控元件，CREs）的转录因子（TFs）实现的。这些CREs在激活或抑制转录中发挥重要作用，并被认为在进化过程中具有保守性（Lieberman-Lazarovich等，2019；Maeso等，2013；Nitta等，2015）。识别关键发育调控基因（如WUSCHEL（WUS）、CLAVATA3（CLV3）和BRC1/TB1）中的CREs具有挑战性，但已成为揭示不同植物物种中发育和驯化性状背后功能调控序列的强大策略（Meyer和Purugganan，2013；Olsen和Wendel，2013；Swinnen等，2016）。尽管已知许多内源和环境信号会影响BRC1/TB1的表达（Barbier等，2019；Wang等，2019），但只有少数CREs在BRC1/TB1基因上游被鉴定出来，例如在水稻和拟南芥中（Lu等，2013；Xie等，2020）。在番茄中，仅在SlBRC1B上游鉴定出BRASSINAZOLE-RESISTANT 1（BZR1）和ELONGATED HYPOCOTYL 5（HY5）的结合位点，并且已被相应的转录因子所识别（Dong等，2023；Xia等，2021）。尽管这些发现为BRC1/TB1基因上游的调控序列提供了见解，但内源和外源信号如何精确影响BRC1启动子活性的机制仍不清楚。因此，需要进一步研究CREs以及未被发现的调控序列的具体体内功能，以理解BRC1依赖的腋生芽生长的复杂调控网络。

在本研究中，我们探讨了番茄中BRC1B的潜在调控区域（启动子和终止子），以揭示SlBRC1B在腋生芽中的调控机制。由于不同物种中的BRC1基因表现出非常保守的表达模式，我们假设这可能表明存在保守的cis-trans调控景观。通过与同源序列进行比较基因组学分析，我们鉴定了SlBRC1B上游的四个高度保守区域（CR1至CR4）。随后，我们通过CRISPR/Cas9诱变技术对这些CR区域进行了修改，导致腋生芽生长显著变化。使用个体CR区域进行酵母单杂交筛选，我们鉴定出GRF、MYB、NAC、锌指和MADS TF家族成员作为其表达的潜在调控因子。我们得出结论，这些CR区域包含关键的CREs，对SlBRC1B的精确调控至关重要。

本研究采用了一系列生物信息学方法，首先通过BLASTp工具从NCBI数据库中筛选出SlBRC1B的同源基因，使用默认参数（BLOSUM62，前100个命中）进行分析。在茄科植物中，BRC1A和BRC1B亚群被识别出来，并将拟南芥和黄瓜的BRC1同源序列纳入保守性分析。从BRC1A和BRC1B亚群成员以及黄瓜基因中获取了5 kb上游序列，并从拟南芥的两个拷贝（AtBRC1和AtBRC2）中获取了2 kb上游序列。使用mVISTA工具，结合LAGAN算法，以50或100 bp窗口进行分析，确定了同源区域。这些设置被称为调整后或默认设置，并在图例中进行了说明。潜在的上游开放阅读框（uORF）使用Expasy Translate工具进行预测。对于motif分析，我们使用MEME工具对5 kb上游区域进行了分析，寻找重复的motif，最多识别十个motif位点（Bailey等，2015）。为了确定共识结合位点，将MEME识别的motif位点与拟南芥的DAP-seq数据库进行比对，使用TOMTOM算法（Bailey等，2009）。

在植物材料和生长条件方面，番茄（Solanum lycopersicum cv. Moneyberg）种子在黑暗中以21°C培养五天用于发芽。幼苗被转移到岩棉上，并在生长室中培养（21°C；16小时/8小时光照/黑暗）以进行短期研究。T0、T1和T2突变体植物被转移到温室隔间（环境温度>20°C；16小时/8小时光照/黑暗，补充钠光）以进行种子生产。在表型分析和基因表达实验中，我们对某些条件进行了调整。发芽后的幼苗在播种后七天（7 DAS）被转移到较大的岩棉块（15 cm x 15 cm），并直接放置在温室的桌面上。为了防止遮荫效应，植物在表型分析和芽收获时被随机化并间隔15 cm或10 cm。

在CRISPR/Cas9诱变方法中，我们针对每个保守区域（CR）选择了四个特定的sgRNA，通过比较sgRNA的on-和off-target效率得分，使用在线工具CRISPOR、CRISPR-p和CHOPCHOP进行筛选。基于Dochen等（2016）和Moreno-Mateos等（2015）的算法，我们选择了最有效的四个sgRNA，具有NGG PAM序列和U6–26启动子兼容性。选定的sgRNA被克隆到之前由Slaman等（2023）构建的level1（L1）CRISPR-pink Golden Gate兼容载体中。L1载体包含人类优化的SpCas9、标记基因如NPTII和GFP，以及四个sgRNA，组合成最终的L2载体。最终的L2构建被转化到农杆菌菌株C58C1中用于植物转化。用于克隆的引物可在补充表S4中找到。

植物转化遵循了van Roekel等（1993）提出的番茄植物转化协议，并进行了适当修改。外植体在培养皿中与农杆菌悬浮液孵育20分钟，并轻轻旋转。随后，悬浮液被移除，外植体转移到含有2,4-Dichlorophenoxyacetic acid（2,4-D）的共培养培养基B1（0.05 mg/L）。两天后，外植体转移到含有zeatin的后培养培养基C（2 mg/L）并去除吲哚-3-乙酸（IAA）。三天后，外植体转移到不含IAA的芽诱导培养基D进行前两周的培养。两周后，使用含有IAA（0.1 mg/L）的培养基D进行芽诱导，并每两周更换一次培养基，直到成功再生。培养基B、C和D中使用的是zeatin而非zeatin riboside。从愈伤组织中生成芽，并使用紫外线灯筛选GFP信号。GFP阳性（转基因）芽被转移到含有IBA（0.25 mg/L）和vancomycin（100 mg/L）的根诱导培养基E。具有良好根系的植物被转移到岩棉上，并通过叶样本（Iribov SBW）确定倍性。选择二倍体芽进行基因型分析以确认所需的突变。

为了选择突变体和T1分离，我们使用Phire Plant Direct PCR（Thermo Scientific）对转基因二倍体植物进行基因型分析。使用特定引物组合对感兴趣的区域进行直接扩增，并通过Sanger测序检测突变。选择T0突变体进行自交，并培养以收获T1种子。在T1代中，选择无Cas9转基因构建的纯合突变体植物，并在缺乏荧光的情况下进行培养以收获T2种子和进一步分析。用于基因型分析的引物列于补充表S4中。

在定性和定量芽生长分析中，每个基因型和处理组种植15株植物。除非另有说明，表型分析在播种后六周（6 WAS）进行，此时植物已长出八到十片叶子。叶子（L）、芽（B）或腋生芽（AS）从L1到L10进行标记，从B1到B10和AS1到AS10分别进行标记。对于定量分析，测量B1和B4从节点到顶极分生组织的长度。长度小于0.5 cm的芽被认为是不活跃的，并标记为0，而长度大于0.5 cm的芽被认为是活跃的，并被计为AS。此外，每株植物在第一到第八片叶子（L1-L8）的腋部中，统计所有长度超过0.5 cm的腋生芽总数。对于去顶组，植物在播种后四周（4WAS）被去顶，此时植物已发育出大约四片叶子。芽量化分析在6WAS时进行，与完整处理组类似。

在定性分析中，芽被分为休眠、过渡或活跃状态，根据叶片原基的伸长程度进行评分。长度小于0.5 cm的芽被标记为休眠或过渡，而长度超过0.5 cm的芽则被标记为活跃。叶片原基完全完整且未伸长的芽被归类为休眠，而原基伸长的芽被归类为过渡。同样，活跃芽或腋生芽根据其营养生长进行评分，其中“v”代表营养生长，数字（0、1、2等）表示每株芽上展开的叶片数量。只有当叶片长度超过2 cm时才被认为是发育完成并被计数。此外，每株植物的展开叶片总数以及到第一花序的叶片数也被统计。所有表型实验均独立重复三次。

在芽收获和基因表达分析中，每种基因型种植8-10株植物，并在播种后四周（4L）于下午4点收获最低的芽。芽收获在双目显微镜下进行，并将8-10个芽按基因型合并到乙腈中。收获后，去除乙腈，并将芽样本进行真空浸润（Park等，2012）。芽样本储存在-80°C直至RNA提取。对于去顶和完整组，芽采样均进行三次重复。

在RNA提取过程中，使用Pico Pure试剂盒（Thermo Scientific）按照制造商说明进行操作，随后使用Turbo DNase（Invitrogen）处理以去除任何残留的DNA。使用120 ng RNA进行cDNA合成反应，使用iScript（Bio-Rad）。实时定量PCR（RT-qPCR）使用SYBR Green Supermix和基因特异性引物进行（补充表S4），在CFX6循环仪（Bio-Rad）上进行，使用两步熔解程序（3分钟95°C，40次[15秒95°C，1分钟60°C]）。根据Livak和Schmittegen等的方法，使用2-ΔC(T)方法计算相对基因表达。选择CLATHRIN ADAPTOR COMPLEXES MEDIUM SUBUNIT（CAC，Solyc08g006960）和EXPRESSED SEQUENCE（EXPRESSED，Solyc07g025390）作为参考基因以获得归一化值（González-Aguilera等，2016）。野生型完整值始终被选作校准，并在图中显示。所有实验均使用三个生物重复进行。

在酵母单杂交（Y1H）筛选和自激活测试中，使用番茄基因组DNA通过CR特异性引子（包含Gateway attB突起）单独扩增每个CR诱饵。扩增的序列通过BP重组克隆到供体载体pDONR221（Invitrogen）中。通过LR重组将包含CR诱饵序列的输入克隆与目标载体pAbai（Takara Bio）连接。通过小规模转化方法将质粒整合到酵母基因组中，CR诱饵载体被分别转化到pJ69-4A菌株中（de Folter和Immink，2011）。转化的克隆通过自激活测试在含有SD-U的培养基上进行筛选，使用不同浓度的Aureobasidin A（AbA）（100-、150-、200-和500- mM ng/ul AbA）。表现出最小自激活率的克隆被选用于转化cDNA库。

在生成番茄腋生芽cDNA库时，所有腋生芽在植物长出两到五片展开叶片时进行采样。采样在立体显微镜下进行，腋生芽被固定在乙腈中，并随后进行真空浸润（Park等，2012）。使用Stratec（Qiagen）试剂盒按照制造商说明进行RNA提取。使用Turbo DNase试剂（Thermo Fisher Scientific）进行DNase处理以消除任何残留的DNA。纯化的RNA用于构建原始cDNA库，使用CloneMiner II试剂盒（Thermo Fisher Scientific）按照制造商说明操作。为了获得腋生芽特异性猎物库，将原始库与pDEST22（Invitrogen）进行LR反应。

在Y1H库转化中，将包含个体诱饵构建的pJ69-4A菌株与番茄腋生芽cDNA库进行转化，按照大规模转化方法（de Folter和Immink，2011）。转化的酵母悬浮液在含有AbA（125 ng/ul）的SD-WU培养基上培养七天。单独生长的酵母菌落被重新悬浮在MQ中，并斑点在新鲜选择培养基上。这些酵母克隆通过Phire Plant Direct PCR（Thermo Fisher Scientific）进行基因型分析。扩增产物通过质粒特异性引子进行Sanger测序（补充表S4）。最后，通过BLASTN搜索SolGenomics数据库确定扩增产物的基因身份。对于尚未在番茄中功能表征的基因，我们通过BLASTp搜索并进行系统发育分析来研究其拟南芥同源基因。

仅选择转录因子进行进一步分析。根据制造商说明，使用Zymo质粒纯化试剂盒（Zymo Research）从酵母细胞中分离这些正向命中质粒。这些质粒被转化到大肠杆菌中，并通过Sanger测序进行确认。分离的质粒随后被转化到含有相应CR诱饵的酵母细胞中以确认结合。选择与初始库筛选相同的AbA浓度和条件进行筛选。

在数据分析中，表型实验使用随机化的植物块进行，为每个基因型创造独特的微环境。使用SPSS软件包进行统计分析，以评估每个数据集内的差异。应用单因素方差分析（ANOVA）来识别均值之间的显著变化。进行事后检验，包括最小显著差（LSD）测试，显著性阈值为P值<0.05和P值<0.01，以及Duncan测试，显著性阈值为P值<0.05，以验证不同基因型之间的统计差异。

研究结果表明，SlBRC1B基因上游存在四个高度保守的区域（CR1至CR4）。这些区域在进化过程中显示出较高的保守性，可能是调控SlBRC1B表达的关键元素。通过CRISPR/Cas9诱变技术，我们对这些区域进行了修改，导致每个CR至少有一个突变体显示出腋生芽生长的减少。其中，CR4 #10和CR4 #13 a2突变体表现出最显著的生长减少。此外，一些CR突变体（如CR1 #14、CR2 #10、CR3 #2和CR4 #10）几乎没有任何生长。这些结果表明，多个CR突变抑制了腋生芽的生长。

在进一步的分析中，我们发现CR4突变体在其他发育方面几乎没有变化。这表明CR4区域的突变主要影响了SlBRC1B的表达水平，而不是其他组织的发育。我们还进行了RT-qPCR分析，以检测CR4突变体中SlBRC1B的表达水平。大多数CR4突变体中SlBRC1B的表达水平与野生型相似，但CR4 #10突变体显示出几乎两倍的表达增加。这表明，尽管CR4突变体在表达水平上变化不大，但它们的表达模式可能在时间和空间上发生了微妙变化，导致芽激活时间的延迟或延长，从而抑制了腋生芽的生长。

通过Y1H筛选，我们鉴定了与CR4结合的锌指、GRF、NAC、MADS和MYB相关转录因子。这些结果表明，这些转录因子可能通过协同作用来调控SlBRC1B的表达。同时，CR4 #10突变体中这些转录因子的结合位点被去除，这可能解释了其生长减少的现象。

本研究的讨论部分强调了BRC1在调控腋生芽生长中的关键作用。尽管BRC1在许多植物中表现出保守的表达模式，但其上游的调控机制仍然不明确。我们通过比较序列分析和体内、体外方法，探讨了SlBRC1B的潜在cis和trans调控因子。通过保守性分析，我们鉴定了四个CR区域（CR1至CR4），它们在不同植物物种中显示出高度保守的特征。这些CR区域可能包含重要的调控元件，如CREs。突变这些区域导致每个CR至少有一个突变体表现出腋生芽生长的减少，这表明CR区域对SlBRC1B的调控至关重要。

研究还指出，BRC1的表达在植物不同组织中可能受到多种转录因子的调控。在番茄中，CR区域的突变对整体生长影响较小，这可能是因为这些区域中的调控因子具有一定的冗余性。此外，我们发现CR区域的突变可能影响SlBRC1B的表达时间和空间分布，从而影响芽的激活时间。这些结果表明，CR区域的调控可能涉及复杂的转录因子网络，这些网络在不同的发育阶段中相互作用，共同维持SlBRC1B的表达水平。

最后，我们探讨了如何利用这些CR区域来改善植物形态。通过针对这些保守的非编码区域进行基因改造，可以显著影响腋生芽的生长。这种方法在番茄中已被证明可以用于调控花序分支和果实大小（Rodríguez-Leal等，2017）。在传统育种计划中，许多性状的改进是通过选择有利的启动子变异来实现的，这些变异可以优化下游基因的表达水平（Meyer和Purugganan，2013；Swinnen等，2016）。例如，番茄果实大小的增加是由于WUSCHEL（WUS）和CLV3基因上游的CREs突变（Mu?os等，2011；Rodríguez-Leal等，2017）。在玉米中，TB1基因上游的转座子插入（hopscotch）导致高表达的tb1变体，这解释了栽培种与其分支的野生祖先（teosinte）之间的显著形态差异（Studer等，2011）。因此，识别和靶向这些CREs可以实现对目标基因表达的调控，从而在不影响植物整体性状的情况下，优化特定性状。