通过非对称聚合酶链反应-Cas12a平台直接从尿液样本中快速鉴定细菌并检测其对抗微生物药物的敏感性

《Analytical Chemistry》：Rapid Bacterial Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing Directly from Urine Samples via an Asymmetric Polymerase Chain Reaction-Cas12a Platform

本研究开发了一种结合不对称PCR（aPCR）和CRISPR/Cas12a的临床诊断平台，可快速从尿液样本中直接鉴定六种常见尿路病原体（103 CFU/mL）并评估抗生素敏感性（60分钟内），经86例临床样本验证，检测准确性与传统培养法一致，总流程仅需5.5小时，显著缩短传统诊断时间（>48小时）。

　　

抗菌素耐药性是一个严重的全球健康挑战，这在很大程度上是由于传统的病原体鉴定（ID）和抗菌素敏感性测试（AST）所需的时间较长所致。在这里，我们提出了一种经过临床验证的诊断平台，该平台结合了非对称聚合酶链反应（aPCR）和CRISPR/Cas12a技术，可以直接从尿液样本中鉴定细菌并进行表型AST检测。与传统需要复杂引物组合的多重PCR不同，我们的平台使用单重aPCR针对16S rDNA的V3–V4区域来生成单链和双链DNA。这种设计使得在需要时可以通过aPCR产生的单链DNA片段来激活Cas12a，从而实现六个常见尿路病原体的物种级多重检测（检测浓度可达10^3 CFU/mL），并且这一过程可以通过可编程的CRISPR/Cas12a crRNA来实现。表型AST检测在60分钟内完成，通过量化抗生素暴露后的核酸变化来准确区分敏感菌株和耐药菌株。在对86份临床尿液样本进行验证后，aPCR–Cas12a平台在携带目标病原体的45份样本中与基于培养的鉴定结果完全一致，并显示出较高的AST检测准确性，证实了其在直接检测病原体和评估尿液中病原体敏感性方面的可靠性。整个工作流程仅需5.5小时，显著缩短了诊断时间（标准方法需要超过48小时）。这一快速、成本效益高且可扩展的平台为感染诊断和抗菌素管理提供了有前景的解决方案，具有很强的潜力应用于常规临床微生物学和即时检测场景。