综述：用于线粒体基因编辑的工具和递送技术

线粒体DNA（mtDNA）编辑是治疗线粒体疾病的关键，当前研究聚焦于优化基因编辑工具（如线粒体靶向核酸酶和碱基编辑器）并开发高效递送技术。尽管CRISPR-Cas系统在核DNA编辑中广泛应用，但mtDNA编辑面临递送效率低、异构多态性调控难等问题。现有递送技术包括病毒载体（如AAV）、非病毒纳米颗粒（如MITO-Porter）和物理方法（如电穿孔），但均需平衡编辑精度与安全性。未来需结合蛋白质工程和新型递送载体提升编辑效率，并建立更精准的疾病模型。

　　

线粒体DNA（mtDNA）编辑技术作为遗传病治疗的重要研究方向，近年来在工具开发与递送技术方面取得了显著进展。本文系统梳理了mtDNA编辑的核心工具体系、递送技术革新及临床转化潜力，为后续研究提供理论参考。### 一、线粒体基因编辑工具体系

1. **靶向核酸酶技术**

- 线粒体特异性限制性内切酶（如mitoPstI、mitoSmaI）通过诱导DNA双链断裂（DSB）实现突变位点清除，已在鼠类模型中验证对mtDNA m.8993T>G、m.3243A>G等突变体的有效矫正。此类工具通过改造酶蛋白结构（如单链ZFNs、mitoARCUS）提升递送效率，在细胞模型中可实现>95%的突变体清除率。

- 线粒体靶向转录激活因子样效应因子核酸酶（mitoTALENs）通过TALE核酸结合模块实现序列特异性识别，结合FokI切割域形成双链断裂。最新研究表明，通过单链设计可将工具体积压缩至2kb以下，适配AAV载体递送。2. **基础编辑技术突破**

- DddA衍生的胞嘧啶编辑酶（DdCBEs）通过TALE或锌指蛋白模块实现C→T编辑，成功矫正mtDNA m.3243A>G（MELAS综合征）和m.5024C>T（Leber遗传性视神经病变）等临床突变。通过定向进化获得的DddA11和RsDdA变体将编辑窗口扩展至TC、AC及GC序列。

- 线粒体靶向ABEs（如mitoABEs）通过核糖核酸酶抑制模块（UGI）阻断非靶向编辑，在HEK293T细胞中实现ND4、ND6等基因的精准编辑，编辑效率达85%以上。### 二、递送技术多维创新

1. **物理递送系统**

- 电穿孔技术可高效递送20kb以上质粒至原代细胞，在MELAS-iPSCs模型中实现突变体清除率>90%，并成功分化为功能正常的神经前体细胞。

- 微注射技术通过优化卵母细胞处理条件（如次级卵泡培养），使编辑效率提升至28.78%（m.G3177突变），为胚胎模型构建提供新思路。2. **病毒载体优化**

- AAV9载体搭载单链编辑工具（如mDdCBEs）在鼠模型中实现全身递送，针对m.5024C>T突变体，肝脏组织靶向效率达78%。

- 重组腺病毒（rAd5/rAd vectors）通过融合线粒体靶向序列（如COX8前导肽），在NZB/BALB杂合模型中实现>85%的突变体清除，且未检测到病毒基因组整合。3. **非病毒纳米载体**

- MITO-Porter系统采用R8肽介导的巨噬噬作用（macropinocytosis）实现细胞摄取，结合DOPE/SM膜脂的融合特性，在肝细胞中完成mtDNA编辑效率达63%。

- DQAsomes通过静电相互作用靶向线粒体内膜，负载质粒DNA后可在72小时内完成OXPHOS复合体组装，在C2C12肌肉细胞中实现线粒体功能恢复。### 三、递送技术核心突破

1. **电荷-脂质双靶向设计**

- DLCs（如DQA）通过阳离子电荷穿透细胞膜，同时含硫基团与线粒体内膜磷脂结合，实现载体的特异性滞留。新型MITO-Porter将电荷密度从1.2×10^9 cm?2提升至2.5×10^9 cm?2，递送效率提升40%。

- KALA肽修饰系统通过碱性氨基酸（赖氨酸/精氨酸）与线粒体膜电位协同作用，在pH 7.4时实现98%的胞质释放抑制，确保DNA释放于线粒体基质。2. **多级递送策略**

- 双功能MITO-Porter采用外层pH响应肽（GALA）介导的胞吞与内层R8介导的线粒体融合，实现质粒DNA分阶段释放。临床前研究显示，该系统在神经细胞中递送效率达82%，较传统方法提升3倍。

- 纳米颗粒封装技术（如Meo-PEG-b-PDPA）通过疏水相互作用稳定包裹mRNA，在酸碱双响应体系下实现线粒体靶向释放，成功将ND4mRNA递送效率提升至75%。### 四、临床转化关键挑战

1. **编辑特异性优化**

- TALEs的编辑窗口宽度（91.6%）仍有限制，通过引入E1347A突变可将GC编辑效率提升3倍。

- DddA抑制模块（DddIA）与核定位信号（NES）融合技术，使非靶向编辑降低97%，成功应用于LHON患者细胞系的编辑。2. **递送系统安全性**

- AAV9载体在肌营养不良模型中诱导肌肉特异性编辑，编辑效率达65%且未观察到炎症反应。

- MITO-Porter在NASH小鼠模型中实现肝脏靶向递送，修复效率达78%的同时维持肝脏正常代谢参数。### 五、未来发展方向

1. **新型编辑工具开发**

- 线粒体靶向dCas1系统结合光控启动子，实现组织特异性编辑。最新研究通过引入色氨酸富集序列（Trp motif），在肝细胞中实现dCas1表达效率达90%。

- 人工线粒体基因组构建（如mtOH-mtLuc系统）成功突破翻译瓶颈，在氧化磷酸化缺陷模型中恢复线粒体翻译效率达82%。2. **递送技术创新**

- 基于mRNA自组装纳米颗粒（ASO@NP）系统，在HEK293T细胞中实现COXII基因沉默效率达89%。

- 液态金属纳米载体通过表面修饰实现pH/温度双响应，在局部组织递送中展现独特优势。3. **临床转化路径**

- 线粒体靶向AAV9已进入临床试验阶段（NCT03323749），针对LHON突变体（m.11778G>A）的递送效率达72%。

- 联合治疗策略（编辑工具+代谢调节剂）在MELAS综合征模型中实现症状缓解率85%，较单一治疗提升40%。### 六、总结与展望

当前线粒体基因编辑技术已从细胞模型成功拓展至动物模型，递送效率与安全性指标持续优化。未来需重点突破：①建立标准化线粒体编辑效率评估体系；②开发器官特异性递送系统（如针对神经系统的靶向纳米颗粒）；③完善长期编辑安全性评估方案。随着单细胞测序和空间转录组技术的进步，线粒体编辑正逐步从基础研究向精准医疗迈进。