综述：竞争与合作：一种结合等温扩增与CRISPR技术的新型一次性检测方法

《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Competition and cooperation: A new idea for one-pot detection by isothermal amplification coupled with CRISPR

本文系统综述了集成等温核酸扩增（INAATs）与CRISPR-Cas系统的单一步骤检测技术，解析了两者竞争互作的分子机制，并评估了空间隔离、温度优化等策略的有效性，为提升诊断灵敏度与特异性提供理论依据。

　　近年来，随着生物医学检测技术的迅速发展，快速、高灵敏度和高特异性的核酸检测方法已成为研究的热点。在这一领域，等温核酸扩增技术（INAATs）因其无需复杂的热循环步骤而备受关注，能够实现快速且高效的扩增。与此同时，基于CRISPR的系统则提供了一种可编程且高度特异性的核酸识别机制，利用Cas蛋白的转切割活性生成可检测的信号。将INAATs与CRISPR技术的优势相结合，以同时实现高灵敏度和高特异性，已成为核心研究方向。此外，一体化检测方法还可以进一步降低操作复杂性，并避免因反复打开反应管盖而导致的气溶胶污染。然而，这种集成方法仍然面临诸多挑战，例如模板降解引起的假阴性、中间扩增产物切割导致的信号延迟，以及引物竞争现象。针对这些问题，研究人员已经提出多种策略，如空间隔离、时间分步处理、降低CRISPR系统活性以及系统优化。本文首次从分子机制的角度，系统性地阐明了等温扩增与CRISPR一体化方法中固有的竞争性相互作用，并讨论了当前提升一体化检测性能的策略，旨在为新型技术的开发提供支持，并推动诊断试剂的进步。

核酸检测技术在疾病防控、早期临床诊断和精准医学中具有关键作用。这种技术能够快速确认病原体感染，使患者能够及时接受治疗，从而显著改善临床结果。特别是在急性传染病爆发期间，如新冠疫情，快速且灵敏的核酸检测技术在病例识别和疫情控制中发挥着重要作用。早期发现有助于有效管理疾病，提高治愈率，减轻患者医疗负担，并优化医疗资源的分配。传统的PCR技术因其高灵敏度和高特异性被广泛认为是核酸检测的“金标准”，但其在操作便捷性和实际应用方面存在一定局限。PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸，其反应时间通常为1至2小时，具体取决于循环次数和每次循环的持续时间。此外，PCR需要通过周期性温度变化来完成变性、退火和延伸，这依赖于专业的热循环设备。这些设备通常体积较大，不便于携带，且需要由受过专业训练的人员在受控的实验室环境中操作。这些缺陷严重限制了PCR在现场检测、资源匮乏地区等场景中的应用。

相比之下，等温核酸扩增技术可以在恒定温度下实现核酸扩增，无需热循环。这种反应可以通过简单的加热设备，如加热块或水浴，进行操作，使其特别适用于需要快速、便携和简便检测的应用场景。随着技术的发展，等温扩增技术的灵敏度已经可以达到与PCR相当的水平，同时显著缩短了扩增时间，通常在30至60分钟内完成。然而，等温扩增技术的特异性仍不如PCR，常常表现为非特异性扩增，如引物二聚体形成或非目标引物的结合。此外，气溶胶污染仍然是某些等温扩增方法面临的重要挑战，尤其是对于环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）等技术。因此，解决这些特异性不足和污染问题，需要开发新的辅助技术或优化生化策略。

CRISPR和CRISPR相关（Cas）系统是一种适应性免疫机制，能够保护许多细菌和大多数古菌免受病毒侵害。自1987年首次被识别以来，CRISPR-Cas系统已经从一个基础生物学概念演变为基因组工程和分子诊断技术的重要基础。一些Cas蛋白，如Cas12、Cas13和Cas14，具有转切割活性，即在目标识别后能够对周围核酸进行非特异性切割。这一特性已被用于开发灵敏、快速且成本低廉的分子诊断方法，通过切割荧光报告分子实现信号检测。基于CRISPR的检测技术提供了一种替代传统方法的有力选择，因为它不需要复杂的设备，简化了操作流程，从而显著提高了检测的可及性。同时，CRISPR技术还具有高特异性和可编程性，能够通过简单调整crRNA来区分单碱基突变并检测不同目标。近年来，基于CRISPR的检测技术已成功应用于多个领域，如疾病诊断、环境监测和食品安全。因此，CRISPR-Cas技术已经成为下一代诊断技术的有力候选。

尽管单独使用INAATs和CRISPR技术存在一定的局限性，但它们在顺序检测格式中结合后展现出巨大的潜力。这种结合方法利用等温扩增技术对目标核酸进行稳健的预扩增，显著提高目标核酸的丰度，随后通过CRISPR-Cas介导的检测提供二次信号放大。因此，整个检测过程的灵敏度得到显著提升。此外，CRISPR-Cas蛋白的可编程性和高特异性有效减少了仅依赖等温扩增时常见的非特异性信号和假阳性率。这种协同效应使CRISPR-Cas技术成为开发高性能诊断技术的重要基石。

最初，INAATs与CRISPR检测的结合是通过分步进行的。已有的CRISPR检测系统，如特定高灵敏度酶促报告解锁（SHERLOCK）、DNA内切酶靶向CRISPR转报告（DETECTR）和一小时低成本多功能高效系统（HOLMES），均是在完成等温扩增反应后才添加CRISPR组件。这种多步骤过程不仅影响了用户体验，还增加了气溶胶污染的风险。相比之下，将扩增与CRISPR整合到一体化系统中，可以在等温条件下实现无缝操作，同时保持临床应用所需的性能。一体化检测方法通过消除繁琐的多步骤反应，显著降低了污染风险并简化了检测流程。这种方法使检测更加迅速和便捷，特别适用于床边检测等现场应用。例如，传统的两步检测通常需要30至60分钟，涉及独立的核酸扩增和多次手动操作，如反复打开试管和移液。相比之下，一体化策略将检测时间缩短至15至30分钟，并消除了液体转移的需要，从而节省了时间和人力。此外，一体化方法还有效克服了两步检测过程中的基本局限，如扩增偏差和转移相关的不准确性，确保了原始目标的更可靠定量。例如，升级后的核酸检测系统HOLMESv2使用了嗜热CRISPR-Cas12b蛋白。通过在等温条件下将其与LAMP扩增结合，该系统实现了在一步反应中对目标核酸的便捷和定量检测。随后，其他系统如CRISPR-TOP和iSCAN-OP也成功实现了一体化核酸检测。因此，一体化系统已成为当前基于CRISPR的诊断技术开发的重要方向。

尽管这些一体化平台展现出巨大的潜力，但它们仍然面临两个显著的技术挑战。首先，温度兼容性是一个重要问题。不同的INAATs使用不同的聚合酶，每种聚合酶都有其最佳扩增温度。因此，某些INAATs可能无法与CRISPR系统的典型操作条件完全兼容，因为CRISPR系统通常在37°C左右，或在20至48°C的范围内最佳运行。例如，LAMP的最佳温度为65°C，接近许多Cas蛋白的失活阈值（如Cas蛋白在65°C下持续10分钟会失活）。这种温度要求的不匹配需要在一体化系统中对两个组分进行相互适应。一些研究已经尝试通过温度优化来解决这一问题。此外，随着热稳定Cas变体的发现，如YmeCas12a、Cas12b、TccCas13a和HheCas13a等，这一问题正在逐步缓解。另一种策略是通过双温度区的分步温度控制，在单管反应中整合两种不同温度要求的检测过程。这种方法可以将LAMP扩增和CRISPR检测分阶段进行，通过微流控芯片上的物理分离双温度区，或在单管内实现顺序温度控制。Sen等人开发了一种基于纸张的LAMP-CRISPR一体化诊断平台（PLACID），通过将LAMP与CRISPR/Cas12a技术整合到带有疏水蜡屏障的纸芯片中，实现了分步温度控制。LAMP反应首先在65°C下进行30分钟，随后在37°C下进行CRISPR切割。此外，通过智能手机控制的红外加热室和自定义的颜色亮度分析算法，该平台实现了现场检测，达到每微升50拷贝的检测限。

然而，更为持久和根本的挑战，即INAATs与CRISPR反应之间的竞争性相互作用，仍然是本文的核心关注点。这种竞争性相互作用并不受Cas蛋白热稳定性的改进所影响。简而言之，在INAATs的早期阶段，原始模板或扩增产物可能会过早激活Cas蛋白的cis切割活性。这会干扰扩增反应达到指数级扩增，并降低整体效率。相反，在Cas复合物识别其特定目标后，Cas蛋白的转切割活性会导致单链DNA（ssDNA）的非特异性降解。这可能会引起对INAATs所需引物或结构探针的意外切割，从而降低检测灵敏度。

近年来，科学界对这一现象的认识不断加深，因此提出了多种解决方案，如空间隔离、时间分步处理、优化引导序列相邻基序（PAM）位点以及系统优化。本文全面探讨了这种干扰的根本原因，并评估了提升一体化检测性能的先进策略。通过整合机制性见解与实际工程方法，我们旨在建立一个支持稳健检测技术开发的框架，并加快创新型诊断试剂的研发和应用。