综述：全细胞和无细胞生物传感器驱动的代谢工程

《Current Opinion in Biotechnology》：Whole-cell and cell-free biosensor-driven metabolic engineering

代谢工程中，全细胞和游离细胞生物传感器通过实时检测代谢物，加速设计-构建-测试-学习循环，优化酶库筛选和代谢路径设计，结合CRISPR技术、定向进化及合成生物学策略，推动生物工厂自动化发展。

　　在现代生物技术领域，代谢工程作为一种关键技术，正在通过微生物细胞工厂的构建来实现高价值产品的高效生产。这些细胞工厂能够利用低成本的底物，通过基因改造和生物合成途径的优化，生产出如生物燃料、氨基酸、萜类化合物等重要化学品。然而，这一过程在设计、构建、测试和学习（DBTL）循环中仍然面临诸多挑战，尤其是如何快速评估代谢产物的浓度变化以及优化生物合成路径。为了解决这些问题，生物传感器的引入成为代谢工程的重要工具。生物传感器通过将目标代谢物的浓度转化为可观察的输出信号，如荧光、发光或颜色变化，从而大大提高了代谢工程的效率。本文将从整体细胞生物传感器（WCB）和无细胞生物传感器（CfB）两个方面，探讨它们在代谢工程中的应用进展及其未来发展方向。

生物传感器的使用使得代谢工程师能够更快速地评估微生物的生产性能，避免了传统方法中繁琐的纯化和色谱分析步骤。整体细胞生物传感器是一种基于活细胞的系统，其原理是通过基因工程手段，使微生物细胞能够感知特定的代谢物，并将其浓度转化为可观测的信号。例如，某些微生物被改造以表达荧光蛋白，当目标代谢物浓度升高时，荧光信号也会增强。这种实时反馈机制使得代谢工程师能够在不依赖额外实验步骤的情况下，直接评估细胞工厂的性能。这种技术已经被广泛应用于筛选高效酶、优化代谢路径以及提高产物产量。

然而，传统的整体细胞生物传感器在筛选过程中仍然存在一些局限性。例如，它们依赖于细胞的生长和基因表达，这可能导致实验周期较长，且需要大量的细胞培养和筛选工作。此外，某些代谢物可能无法被现有的转录因子（TF）有效感知，从而限制了生物传感器的应用范围。为了解决这些问题，研究人员开发了多种替代策略，如利用次级分子作为信号载体，或者通过酶催化将目标代谢物转化为可检测的代谢物。这些方法提高了生物传感器的适用性，使得更多种类的代谢物能够被监测。

另一方面，无细胞生物传感器则通过利用转录和翻译机制，实现了独立于细胞生长的检测功能。这种方法可以显著缩短实验周期，因为它避免了细胞培养和基因转化等耗时步骤。无细胞系统通常由细胞裂解物组成，其中包含了必要的酶和蛋白质，能够在体外环境中进行基因表达和代谢物检测。这种系统的优势在于其灵活性和可扩展性，使得代谢工程师能够更快速地测试不同的基因组合和代谢路径。

尽管无细胞生物传感器在效率上具有明显优势，但在筛选基因库方面仍面临一定挑战。整体细胞系统可以通过将不同的基因变异引入单个细胞中，实现单细胞级别的筛选和选择。而无细胞系统则需要更为系统的方法来分配和回收基因库，这可能影响其筛选效率。为了解决这一问题，研究人员开发了基于水包油乳滴的高通量筛选方法，这种方法可以将不同的基因库分配到独立的乳滴中，从而实现更高效的筛选。此外，一些创新技术如利用微流控设备生成含有基因的乳滴，以及通过PCR策略生成线性表达模板，进一步提升了无细胞生物传感器的筛选能力。

随着生物技术的不断进步，生物传感器的应用范围也在不断扩大。特别是在CRISPR技术的支持下，整体细胞生物传感器能够更精确地调控基因表达，从而实现更高效的代谢路径优化。例如，CRISPRi（CRISPR干扰）技术被用于筛选特定基因的调控目标，通过抑制基因表达来提高目标代谢物的产量。同样，CRISPRa（CRISPR激活）技术则被用于增强基因表达，从而优化代谢路径。这些技术的结合使得代谢工程师能够更系统地分析和优化基因表达水平，提高产物的产量和质量。

在无细胞系统中，生物传感器的应用同样取得了显著进展。通过利用不同微生物的细胞裂解物，研究人员能够构建出广泛的生物元件库，包括启动子和核糖体结合位点（RBS）。这些生物元件的组合可以用于调控基因表达，从而优化代谢路径。此外，无细胞生物传感器还能够用于快速评估酶组合的效果，使得代谢工程师能够在体外环境中筛选出最有效的酶组合，再将其转移到实际的细胞工厂中进行测试。

生物传感器的应用不仅限于代谢产物的检测和优化，还扩展到了生物元件的开发和验证。例如，一些研究利用无细胞系统来快速验证预测的生物元件表达强度，从而加速了代谢工程的设计过程。此外，无细胞生物传感器还被用于构建合成生物系统，这些系统能够模拟复杂的代谢网络，为代谢工程提供更多的实验数据和理论支持。

随着自动化技术的发展，生物传感器与生物制造设施（biofoundries）的结合为代谢工程带来了新的机遇。生物制造设施通过整合机器人技术，实现了对生物实验的自动化操作，从而大幅减少了人工干预，提高了实验效率。在这些设施中，生物传感器被用于实时监测和优化代谢路径，使得代谢工程能够更快速地进行设计和测试。例如，一些研究表明，通过结合生物传感器和人工智能技术，可以实现对酶设计和筛选的自动化，从而显著提高代谢工程的效率和成功率。

尽管生物传感器在代谢工程中取得了诸多进展，但仍然面临一些挑战。例如，生物传感器的动态范围和灵敏度仍有待提高，以适应更广泛的代谢物浓度变化。此外，生物传感器的构建和优化需要大量的实验数据和计算资源，这对实验条件和设备提出了更高的要求。为了解决这些问题，研究人员正在探索更先进的生物传感器设计方法，包括利用机器学习技术进行传感器组件的预测和优化，以及开发具有更广动态范围的生物传感器。

总体而言，生物传感器在代谢工程中的应用为高价值产品的生产提供了强有力的支持。无论是整体细胞生物传感器还是无细胞生物传感器，它们都在不同的应用场景中发挥了重要作用。未来，随着技术的不断进步，生物传感器有望在代谢工程中实现更广泛的应用，推动这一领域向更加高效和智能化的方向发展。