DNA复制叉速度作为大脑皮层神经发生的核心节律调控因子

《Nature Communications》：DNA replication fork speed acts as a pacer in cortical neurogenesis

本研究聚焦于DNA复制叉速度在神经发生中的未知调控作用。研究人员通过条件性敲除Mcmbp基因，发现其缺失会加速神经前体细胞（RGCs）的DNA复制叉速度，进而引发DNA损伤、p53依赖性凋亡和小头畸形。意外的是，Mcmbp/Trp53双敲除进一步加速复制叉速度，导致RGCs脱离脑室区并获得外放射状胶质细胞（oRGCs）特征。该研究揭示了复制叉速度通过协调DNA复制与中心体复制调控神经前体细胞命运的新机制，对理解神经发育障碍具有重要意义。

　　

大脑皮层的正常发育对哺乳动物的高级神经功能至关重要，这一过程依赖于神经前体细胞（NPCs）精确的增殖与分化。然而，在这一复杂过程中，DNA复制速度如何影响神经前体细胞的命运决定，此前仍是一个未被深入探索的领域。DNA复制是细胞分裂的基础，其速度的精确调控对维持基因组稳定性至关重要。已有研究表明，在皮质发育过程中，神经前体细胞的S期持续时间随着神经发生的进行而逐渐缩短，但其背后的调控机制及失调后果尚不清楚。

发表在《Nature Communications》上的这项研究，首次揭示了DNA复制叉速度在大脑皮层神经发生中扮演的“节律器”角色。研究人员发现，MCM结合蛋白（MCMBP）通过调控新生MCM复合体的组装和核转运，从而限制复制叉速度。当研究人员利用Emx1Cre在小鼠胚胎大脑的神经前体细胞——放射状胶质细胞（RGCs）中条件性敲除Mcmbp基因后，引发了一系列连锁反应。

为了探究MCMBP的功能，研究团队首先构建了Mcmbp条件性敲除（cKO）小鼠模型。他们发现Mcmbp在神经前体细胞中高表达，并随发育进程逐渐下降。cKO小鼠出生后表现出皮质变薄、上层神经元减少的典型小头畸形表型。机制上，Mcmbp缺失导致RGCs中DNA复制叉速度显著加快，复制起点间距增大，引发了广泛的DNA损伤（γH2AX焦点形成）和p53信号通路的激活，最终导致细胞大量凋亡。有趣的是，当研究人员同时敲除Trp53和Mcmbp（dKO）时，虽然细胞凋亡被抑制，大脑尺寸得到部分挽救，但复制叉速度反而进一步加快。更令人意外的是，dKO小鼠的RGCs逐渐从脑室区（VZ）脱离，并获得了表达HOPX的外放射状胶质细胞（oRGCs）的特征。这些脱离的RGCs表现出缩短的S期时长和增强的增殖能力。单细胞RNA测序分析进一步证实了这些脱离的RGCs具有独特的分子特征。研究还发现，MCM复合体不仅参与DNA复制，还与中心体蛋白PCNT相互作用，共同调控中心体的复制和完整性，这对于RGCs在脑室区的锚定至关重要。在dKO小鼠中，中心体组分（如PCNT、ARL13B）显著减少，中心体数目异常，纤毛结构和数量受损，这解释了RGCs脱离的原因。此外，dKO小鼠皮质中还出现了血管过度生长的现象。行为学分析表明，胚胎期由复制叉加速导致的复制应激，会对成年小鼠产生持久影响，使其表现出焦虑样行为。

本研究主要采用了以下关键技术方法：通过条件性基因敲除小鼠模型（Mcmbp cKO和Mcmbp/Trp53 dKO）进行在体功能研究；利用DNA纤维技术（DNA fiber assay）直接测量复制叉速度和起点间距；通过免疫荧光染色、Western blotting和co-IP等技术分析蛋白表达、定位和相互作用；采用RNA测序（包括bulk RNA-seq和单细胞RNA-seq）进行转录组分析；使用流式细胞术进行细胞周期分析；并利用3D行为分析系统评估小鼠行为表型。实验所用小鼠脑组织样本来源于不同胚胎期和出生后的小鼠。

Mcmbp表达对皮质发育至关重要

研究人员发现Mcmbp在神经前体细胞中富集表达，并随发育进程下降。成功构建Mcmbp cKO小鼠后，观察到其出生后出现皮质变薄、上层神经元（BRN2⁺, LHX2⁺）显著减少的小头畸形表型，而深层神经元（TBR1⁺）基本不受影响。从E12.5到E16.5，cKO小鼠的SOX2⁺RGCs和EOMES⁺中间前体细胞（IPCs）数量进行性减少，并在后期出现RGCs脱离脑室区的现象。

Mcmbp缺失诱导快速凋亡和细胞周期退出

在细胞凋亡高峰E15.5期，cKO皮质脑室区（VZ）和脑室下区（SVZ）出现大量cleaved caspase-3 (CC3)阳性和核固缩的凋亡细胞。细胞周期分析显示，cKO RGCs在经历S期后24小时内大量凋亡，并出现细胞周期提前退出和分化失败的现象。

Mcmbp缺失引发严重DNA损伤和p53激活

RNA-seq分析显示cKO皮质中p53信号通路显著上调。免疫染色证实p53及其磷酸化（p-p53 Ser15）以及DNA损伤标记γH2AX在cKO RGCs中显著增加。DNA纤维实验直接证实cKO RGCs的复制叉速度加快、起点间距增大、复制叉不对称性增加。离体培养的cKO NPCs同样表现出增殖缺陷和DNA损伤。

Trp53/Mcmbp双敲除显著挽救小头畸形表型

与cKO相比，dKO小鼠的体型、皮质尺寸和上层神经元数量得到明显恢复，细胞凋亡被完全抑制。然而，DNA损伤水平（γH2AX⁺细胞）在dKO中反而进一步升高，且复制叉重启能力在cKO和dKO中均受损。

Trp53/Mcmbp双敲除导致RGCs大量脱离脑室区

尽管dKO中SOX2⁺RGCs和EOMES⁺IPCs总数得到恢复，但其中大部分细胞脱离其正常位置（VZ/SVZ），异位分布到中间区（IZ）等区域。这些脱离的RGCs从E13.5开始出现，并持续存在至E17.5。

脱离的前体细胞显示S期缩短和增殖能力增强

dKO细胞的转录组特征显示细胞周期、DNA复制相关通路上调。流式细胞术和双胸苷类似物标记实验证实dKO RGCs的S期时长和总细胞周期时长缩短。长期EdU标记显示dKO中具有增殖能力的SOX2⁺Ki67⁺细胞比例增加。

单细胞分析揭示Trp53/Mcmbp缺陷RGCs的独特表达特征

单细胞RNA测序发现dKO皮质中IPC_cluster12增多而RGC_cluster10减少。差异表达分析显示，脱离的RGCs（如cluster10）中DNA复制相关基因下调，而中枢神经系统发育相关基因上调。dKO皮质中还伴有血管过度生长，且血管与HOPX⁺前体细胞关系密切。

RGCs脱离脑室区源于中心体复制和完整性的破坏

Western blotting显示cKO和dKO细胞的细胞核和细胞质中MCM2-7亚基（尤其是MCM3）表达均下降。免疫染色发现cKO和dKO的RGCs中心体数目异常（PCNT焦点数减少）、纤毛（ARL13B⁺、乙酰化微管蛋白标记）结构和分布严重破坏，且dKO中缺陷更严重。Co-IP实验证实p53、MCM3与中心体蛋白PCNT之间存在相互作用。

Mcmbp缺失导致的复制应激引发焦虑样行为

对成年小鼠的行为学分析显示，尽管dKO小鼠的大脑结构得到挽救，但其与cKO小鼠一样，在开放场实验中表现出中心区域活动时间减少等焦虑样行为。三维运动特征的主成分分析（PCA）也能将cKO和dKO小鼠与对照组区分开来。

本研究得出结论：DNA复制叉速度是皮质神经发生的一个关键“节律器”。MCMBP通过调控MCM复合体的稳定性来限制复制叉速度，其缺失会导致复制叉加速、基因组不稳定和p53依赖性凋亡。p53的缺失虽然能挽救细胞死亡，但却意外地导致复制叉进一步加速，并引发RGCs脱离脑室区及获得oRGCs样特征。这一转变揭示了复制叉速度、中心体完整性和细胞命运决定之间的新型联系。该研究不仅阐明了DNA复制动力学在神经发育中的核心作用，为理解小头畸形等神经发育障碍提供了新视角，而且提示胚胎期的复制应激可能对远期神经精神行为产生持久影响。研究发现的Mcmbp/Trp53双敲除模型中出现的oRGCs样细胞，为探索灵长类大脑皮层扩张的进化机制提供了有趣的线索。