转录因子TCF4通过Sema7a-Plxnc1介导的神经元-星形胶质细胞通讯调控大脑胼胝体形成过程中半球间中线的重塑

《Translational Psychiatry》：Transcription factor 4 regulates the interhemispheric midline remodeling through neuron–astroglia communications during corpus callosum formation

本研究聚焦于Pitt-Hopkins综合征（PTHS）致病基因TCF4在胼胝体发育中的关键作用。研究人员通过条件性基因敲除、单细胞测序等技术，揭示了Tcf4通过调控神经元来源的Sema7a与星形胶质细胞受体Plxnc1之间的通讯，介导半球间中线结构重塑，从而保障胼胝体正常形成。该发现为理解TCF4相关神经发育障碍的潜在机制提供了新视角。

　　

大脑半球之间的高效通信是高级认知功能的基础，而胼胝体（Corpus Callosum, CC）作为连接两侧大脑半球的最大神经纤维束，在这一过程中扮演着关键角色。胼胝体发育不全（Agenesis of the Corpus Callosum）是一种常见的脑结构异常，在新生儿中的发生率约为每1万人中1.8至16.6例，并与智力障碍、癫痫和自闭症谱系障碍等多种神经发育疾病密切相关。值得注意的是，精神分裂症患者中也经常观察到胼胝体异常，凸显了其对高级脑功能的重要性。然而，导致胼胝体发育不全的根本原因仍不清楚。

胼胝体的形成受到一系列发育过程的精密调控，包括皮质隔边界（Corticoseptal Boundary, CSB）的模式化、半球间裂隙（Interhemispheric Fissure, IHF）的融合以及胼胝体轴突在半球间中线的交叉。在这一过程中，引导细胞（guidepost cells），如半球间中线内的星形胶质细胞和扣带皮层先驱神经元，为胼胝体连合轴突跨越中线提供关键的导向信号。同时，新皮层中产生的胼胝体投射神经元（Callosal Projection Neurons, CPNs）将其轴突伸向中线，这些轴突跟随扣带皮层先驱神经元的轴突路径，促进胼胝体的形成。这些过程中的缺陷可导致胼胝体部分或完全发育不全。

转录因子4（Transcription Factor 4, TCF4，也称为E2-2）是碱性螺旋-环-螺旋（basic Helix-Loop-Helix, bHLH）家族的成员。TCF4基因突变会引起Pitt-Hopkins综合征（Pitt-Hopkins Syndrome, PTHS），这是一种以严重智力障碍为特征的自闭症谱系障碍，并且与精神分裂症高度相关。胼胝体发育不全是PTHS患者的一个关键特征。然而，Tcf4调控胼胝体发育，特别是胼胝体中线结构形成的机制尚属未知。

为了解决这一科学问题，复旦大学脑科学研究所、脑功能与脑疾病全国重点实验室的谢云立课题组在《Translational Psychiatry》上发表了他们的最新研究成果。他们发现，Tcf4介导的神经元-星形胶质细胞通讯对于建立中线结构和后续的胼胝体形成至关重要。

研究人员运用了多种关键技术手段来探索Tcf4的功能。他们采用了条件性基因敲除技术，利用Emx1-Cre和Nex-Cre小鼠品系分别在端脑或分裂后神经元中特异性敲除Tcf4。通过磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）和尼氏染色（Nissl Staining）评估了成年和 postnatal day 7 (P7) 小鼠的胼胝体结构。子宫内电穿孔（In Utero Electroporation, IUE）技术被用于在特定发育时间点（如E12.5, E13.5, E14.5）标记和操作特定神经元群体（如先驱神经元、CPNs），以观察其轴突投射。体外移植实验（Ex Vivo Transplantation Assay）则用于区分细胞自主性和非自主性缺陷。免疫组织化学（Immunohistochemistry）用于检测和定位各种细胞标志物，如SATB2、CTIP2、CB、GFAP、SOX9、L1cam、Laminin等。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine, EdU）掺入实验用于评估细胞增殖。原位杂交（In Situ Hybridization）用于检测Mmp2和Sema7a的mRNA表达。研究还利用从E16.5小鼠胚胎半球间中线区域显微解剖获得的细胞进行了单细胞RNA测序（Single-Cell RNA Sequencing, scRNA-seq），并结合Slingshot轨迹推断、RNA velocity分析和CellChat细胞间通讯分析等生物信息学方法。双荧光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase Assay）用于验证TCF4对Sema7a转录的调控作用。此外，还使用了针对Sema7a的短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）进行功能缺失研究。

Tcf4是半球间中线结构形成所必需的

Tcf4在发育中的大脑广泛表达，尤其在CSB区域表达水平很高。为了研究Tcf4是否在调控半球间中线结构形成中发挥作用，研究人员利用Emx1-Cre介导的重组在端脑条件性敲除了Tcf4。成年小鼠的磁共振成像，特别是弥散张量成像（Diffusion Tensor Imaging, DTI）显示，野生型（Wild-Type, WT）小鼠存在清晰的胼胝体纤维束，而在Tcf4条件性敲除（Tcf4 cKO）小鼠中，胼胝体结构显著减小，并伴有脑室扩大，这与PTHS患者的胼胝体结构异常表型相似。对P7小鼠脑切片的尼氏染色进一步证实，Tcf4 cKO小鼠的胼胝体结构缺失。通过子宫内电穿孔在E14.5标记CPNs的前体细胞，发现在P0时，WT小鼠的GFP阳性轴突能够正确导航并跨越半球间中线到达对侧皮层，而Tcf4 cKO小鼠的轴突则无法跨越中线，形成了Probst束（Probst bundles），这是胼胝体异常的一个标志性特征。这些数据表明Tcf4对于建立半球间中线结构和胼胝体发育至关重要。

CSB结构异常并非源于Tcf4在CPNs中的缺失

胼胝体中的大部分轴突来源于表达转录因子Satb2的2/3层CPNs。研究人员首先检查了Tcf4缺失是否影响皮层神经发生，特别是SATB2阳性CPNs的分化。免疫染色显示，Tcf4 cKO大脑中SATB2阳性CPNs和CTIP2阳性神经元的密度与WT相比没有改变，表明CPNs的特性未受影响。为了研究Tcf4在扣带皮层先驱神经元（pioneer neurons）中的作用，研究人员在E13.5向Tcf4f/f小鼠的扣带皮层进行子宫内电穿孔，以特异性敲除先驱神经元中的Tcf4。结果发现，GFP标记的轴突在胼胝体中的占据率与对照组相似，能够正确投射，且CSB结构保持完整。为了进一步确认，研究人员在E14.5使用Doublecortin（Dcx）启动子驱动的CRE特异性敲除CPNs中的Tcf4，发现这些轴突仍能正常投射到对侧皮层。这些结果表明，CSB结构的畸形并非源于CPNs的发育缺陷或其轴突投射异常。

半球间中线缺陷导致Tcf4突变体中胼胝体发育不全

为了探究Tcf4突变体中胼胝体发育不全是否源于半球间中线的缺陷，研究人员进行了体外移植实验。他们将来自WT或Tcf4 cKO胚胎的皮层外植体（表达GFP）移植到年龄匹配的宿主脑切片中。当WT外植体移植到WT宿主时，WT CPNs的轴突成功跨越了中线。然而，当WT外植体移植到Tcf4 cKO宿主切片时，WT CPNs的轴突未能跨越中线，而是向腹侧穿透。相反，当Tcf4 cKO外植体移植到WT宿主切片时，缺乏Tcf4的CPNs轴突能够延伸跨越中线。这些结果证明，Tcf4 cKO突变体中的胼胝体异常主要是由于CSB内的半球间中线存在缺陷所致。

Tcf4缺失破坏了CSB的模式化

CSB内的引导神经元和星形胶质细胞对于建立其结构至关重要。为了研究Tcf4 cKO中CSB的模式化是否发生改变，研究人员在E17.5（CSB结构建立时）检查了CSB的组织结构。在WT大脑中，CB阳性的引导神经元在IHF两侧形成紧凑的簇状分布。而在Tcf4 cKO大脑中，尽管CB阳性神经元的数量与WT相似，但这些神经元在扣带皮层中分布稀疏。星形胶质细胞标志物GFAP的免疫染色显示，Tcf4 cKO大脑中GFAP表达增强且分布更偏向腹侧。SOX9（一种在RGCs和分化星形胶质细胞中表达的转录因子）阳性星形胶质细胞在WT大脑中定位正确：灰被胶质细胞（Indusium Griseum Glia, IGG）分布在胼胝体上方，中线拉链胶质细胞（Midline Zipper Glia, MZG）位于其下方，迁移的胶质细胞很少出现在胼胝体纤维束内。相比之下，Tcf4 cKO大脑显示SOX9阳性星形胶质细胞在腹侧CSB显著累积，IGG和MZG之间缺乏清晰的分区，且SOX9阳性细胞数量增加。统计分析表明，Tcf4 cKO大脑中CB阳性神经元分布更分散，SOX9阳性细胞主要累积在更腹侧的位置。进一步研究发现，SOX9阳性细胞的增加并非源于从脑室区的重新分布，而是由于IG区域的过度增殖所致。对IHF重塑的分析发现，WT大脑表现为融合的隔和回缩的IHF，而Tcf4 cKO大脑则显示未融合的隔和几乎贯穿整个端脑中线的残留IHF。胼胝体轴突未能跨越中线，而是形成了与中线平行的同侧Probst束。此外，星形胶质细胞分泌的基质金属蛋白酶2（Matrix Metalloproteinase 2, MMP2）对于清除软脑膜至关重要，原位杂交显示Mmp2的表达在Tcf4 cKO大脑中降低。这些数据表明Tcf4缺失破坏了CSB的正常模式化，并导致IHF融合的严重缺陷。

引导神经元中Tcf4的缺失影响CSB中星形胶质细胞的分布

谱系追踪实验证实，CSB中的CB阳性神经元来源于Emx1谱系，而SOX9阳性星形胶质细胞则来源于Zic4谱系。这意味着由Emx1-Cre介导的Tcf4缺失所导致的CSB缺陷，是由于Emx1谱系来源的神经元中Tcf4的缺失造成的。为了进一步探索Tcf4在CSB神经元中缺失如何影响CSB结构，研究人员将Tcf4f/f小鼠与Nex-Cre品系（CRE在分裂后神经元中被激活）杂交。结果发现，在Tcf4f/f; NexCre大脑中，半球间中线结构被显著破坏，出现严重的胼胝体畸形，IHF未融合，CB阳性引导神经元定位错误，SOX9阳性引导星形胶质细胞数量增加。这些结果进一步证明，当Tcf4从引导神经元中缺失时，引导星形胶质细胞的分布受到干扰，提示神经元和胶质细胞之间的非细胞自主性调控在胼胝体形成中扮演重要角色。

CSB的单细胞RNA测序分析揭示Sema7a-Plxnc1是神经元与星形胶质细胞间关键信号

为了理解Tcf4如何调控半球间中线结构的建立，研究人员对E16.5 WT和Tcf4 cKO胚胎大脑的CSB区域进行了单细胞RNA测序分析。细胞聚类分析鉴定出6个主要细胞簇：放射状胶质细胞（Radial Glial Cells, RGCs）、中间祖细胞（Intermediate Progenitor Cells, IPC）、循环RGCs（cyclingRGCs）、未成熟锥体神经元（immature Pyramidal Neurons, imNeuron）、锥体神经元（Pyramidal Neurons, PN）和星形胶质细胞（Astroglia, Astro）。轨迹推断和RNA velocity分析表明，Emx1和Zic4谱系贡献了CSB中不同的细胞群体。比较WT和Tcf4 cKO的细胞簇发现，Tcf4缺失特异性地扰乱了锥体神经元簇，而胶质细胞簇则高度重叠。通过CellChat分析细胞间通讯，发现大多数信号通路在Tcf4 cKO和WT之间相似，但由锥体神经元起始的Sema7信号通路在Tcf4 cKO中完全缺失。进一步分析显示，在WT条件下，Sema7通路是唯一由锥体神经元起始并被星形胶质细胞和cyclingRGCs接收的显著信号通路。网络中心性分析表明，锥体神经元是Sema7配体的主要来源，而cycling RGCs和星形胶质细胞是主要接收者。具体而言，Sema7a-Plxnc1配体-受体对是该通路的关键贡献者。表达分析证实Sema7a由锥体神经元表达，而Plxnc1主要由星形胶质细胞和cycling RGCs表达。这些结果表明，CSB内神经元与星形胶质细胞间的通讯主要由Sema7a-Plxnc1通路介导，Tcf4的缺失严重破坏了这一通路。

星形胶质细胞来源的Fgf信号调控连合发育

在胼胝体发育过程中，Fgf信号通路对于轴突投射、IGG迁移和软脑膜清除至关重要。CellChat分析发现，在WT小鼠中，星形胶质细胞是Fgf配体的主要来源，而RGCs、cyclingRGCs和锥体神经元是主要接收者。当Tcf4条件性缺失时，Fgf信号受到抑制，但锥体神经元未受影响。主要的配体-受体对在WT中是Fgf15-Fgfr1和Fgf8-Fgfr1，而在Tcf4 cKO中则转变为Fgf15-Fgfr2。这些发现提示，在CSB发育过程中，Fgf信号源自星形胶质细胞并靶向锥体神经元，星形胶质细胞的异常可能通过Fgf信号通路反馈性地破坏锥体神经元。

Sema3c信号通路主要在胼胝体发育过程中介导神经元内在通讯

Sema3c信号通路在胼胝体发育中通过对CPNs轴突的吸引作用发挥重要功能。分析显示，Tcf4缺失后，Sema3c信号的整体通讯强度保持不变，其主要来源和靶点是投射神经元和未成熟神经元。尽管PN-to-PN的通讯模式基本保留，但略有减少，表明Sema3c信号主要在神经元簇内部运作。此外，在Tcf4 cKO中发现了新的配体-受体组合，提示存在受体组成的补偿性变化。

Sema7a信号调控半球间中线发育

为了确定Sema7a-Plxnc1通路是否是半球间中线发育的关键信号通路，研究人员通过原位杂交在E16.5检测了Sema7a在CSB的表达。与scRNA-seq结果一致，Sema7a mRNA在靠近中线的CSB区域被检测到，但在Tcf4 cKO大脑中其表达显著降低，提示Tcf4可能促进Sema7a的表达。双荧光素酶报告基因检测证实，TCF4与Sema7a启动子区域结合时，荧光强度显著增加，而当Tcf4的bHLH结构域缺失时，这种激活作用消失。为了研究Sema7a下调如何影响半球间中线重塑和胼胝体发育，研究人员设计了靶向Sema7a的shRNA，并在E12.5通过子宫内电穿孔递送到CSB区域。结果发现，单侧干扰Sema7a导致Laminin阳性的IHF异位残留和胼胝体畸形（14个大脑中有9个）。对CSB模式化的分析显示，引导细胞（包括CB阳性神经元和SOX9阳性星形胶质细胞）出现异常分布。这些数据证明Sema7a信号是CSB发育所必需的，而CSB发育对于后续CPNs轴突导航形成胼胝体至关重要。

本研究揭示了TCF4在调控胼胝体形成中的关键作用机制。研究人员发现，Tcf4通过介导神经元（特别是Emx1谱系来源的引导神经元）与星形胶质细胞（Zic4谱系来源）之间的通讯，来调控半球间中线的重塑。这种通讯的核心分子机制是神经元表达的Sema7a与星形胶质细胞表达的受体Plxnc1构成的信号通路。Tcf4通过其bHLH结构域直接促进Sema7a的转录。在正常发育过程中，紧凑分布的引导神经元和高水平表达的Sema7a， together with 功能正常的星形胶质细胞（分泌MMP2促进IHF融合），共同为胼胝体轴突的跨越创造了适宜的微环境。而当Tcf4缺失时，Sema7a表达下降，引导神经元分布紊乱，星形胶质细胞定位和功能受损（MMP2减少），导致IHF无法正常融合，最终引起胼胝体发育不全。

这项研究不仅阐明了Tcf4在胼胝体发育中的非细胞自主性作用机制，将TCF4这一重要的神经发育障碍风险基因与特定的细胞通讯通路（Sema7a-Plxnc1）联系起来，而且强调了神经元-胶质细胞相互作用在构建复杂脑结构中的重要性。这些发现为理解PTHS等TCF4相关神经发育障碍中胼胝体异常的病理机制提供了新的视角，并可能为未来开发干预策略提供潜在的靶点。论文发表在《Translational Psychiatry》期刊，凸显了其从基础研究发现向临床意义转化的重要性。