通过体内工程改造转基因小鼠，以产生针对金黄色葡萄球菌肠毒素B的全身性人源中和抗体

《Frontiers in Immunology》：In Vivo engineering of transgenic mice for systemic human neutralizing antibody production against staphylococcal enterotoxin B

单克隆抗体在转基因动物生物反应器中的稳定表达及保护效果研究。通过CRISPR/Cas9介导的精准基因组整合，构建携带抗SEB人源抗体基因的ROSA26和H11转基因小鼠模型，实现血清（208±24 mg/L）、乳汁（43±2.3 mg/L）和唾液（24±3.6 mg/L）等多体液系统持续表达，抗体亲和力（ROSA26：0.108 nM；H11：0.154 nM）显著高于CHO细胞表达版本（0.18 nM），且在140周内保持稳定表达和完整遗传稳定性，成功抑制SEB毒素诱导的休克模型。该技术为生物制药和抗毒素牲畜开发提供新平台。

　　这项研究提出了一种利用基因工程小鼠作为生物反应器的新方法，用于生产针对特定病原体的治疗性单克隆抗体。传统的单克隆抗体生产主要依赖于哺乳动物细胞培养系统，尤其是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，这种系统虽然成熟且广泛应用，但其成本高昂、操作复杂，并且在大规模生产方面存在一定的局限性。为了克服这些限制，研究人员采用了一种基于CRISPR/Cas9技术的定点基因整合策略，将人类抗金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）的单克隆抗体（LXY-Ab）基因插入到两个已知的基因组安全着陆位点：ROSA26和Hipp11（H11）。这些安全着陆位点在进化过程中保持高度保守，能够提供稳定的基因表达环境，同时避免随机整合带来的基因调控不稳定性和表达水平波动。

通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑，研究人员成功构建了两种基因工程小鼠模型，这些小鼠在不同生物流体中表现出高效的抗体分泌能力。在实验中，两种模型分别在ROSA26和H11位点成功整合了LXY-Ab的重链和轻链基因，实现了跨组织的抗体表达。实验数据显示，ROSA26-KI小鼠的抗体分泌水平在血清中达到208 mg/L，在乳汁中为43 mg/L，而在唾液中平均为24 mg/L。H11-KI小鼠的血清抗体浓度也达到了207.9 mg/L，唾液中为25.8 mg/L。这些结果表明，该方法能够在多个生物流体中稳定地产生具有功能性的全人源抗体，且这种表达能力持续超过140周，同时不影响小鼠的存活率，并且在连续六代中保持了基因的稳定传递。

为了确保基因整合的准确性和稳定性，研究人员采用了多种分子生物学方法进行验证。其中包括多重PCR技术，用于检测基因整合的位置，并通过Southern blot分析确认了整合后的基因组结构。此外，通过Sanger测序进一步验证了整合的精确性，排除了随机整合的可能性。这些验证步骤确保了实验结果的可靠性，并为后续的抗体功能分析提供了坚实的基础。

在抗体的功能性评估方面，研究团队通过多种实验方法确认了LXY-Ab在ROSA26和H11位点的表达效果。例如，通过Western blot分析，研究人员观察到在减性条件下，重链和轻链的表达强度在纯合子（KI/KI）小鼠中显著高于杂合子（KI/+）小鼠。同时，在非减性条件下，抗体的完整结构也得到了验证，显示出完整的IgG分子（约150 kDa）。这些结果表明，LXY-Ab在基因工程小鼠体内不仅能够正确表达，而且具有完整的结构和功能。

进一步的功能性研究显示，基因工程小鼠产生的LXY-Ab具有比CHO细胞培养系统中表达的LXY-CHO更高的结合亲和力。通过表面等离子体共振（SPR）技术，研究人员测量了抗体与SEB的结合动力学，发现LXY-R26（ROSA26位点）和LXY-H11（H11位点）的结合常数（Kd）分别为0.108 nM和0.154 nM，均显著低于LXY-CHO的Kd值（0.18 nM）。这意味着，通过基因工程小鼠生产的人源抗体在结合目标抗原的能力上更具优势，可能在治疗效果上优于传统方法。此外，通过竞争ELISA实验，研究人员确认了LXY-R26和LXY-H11与LXY-CHO在表位特异性方面完全一致，进一步验证了其功能性。

除了结合亲和力的提升，研究还发现基因工程小鼠产生的抗体在N-糖基化模式上与CHO细胞表达的抗体存在显著差异。通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）分析，研究人员发现LXY-Ab在基因工程小鼠血清中表现出更高的岩藻糖基化比例（70%）和较高的高甘露糖型糖基化比例（20%），而CHO细胞表达的LXY-CHO则以复杂的混合型糖基化为主（25.8%），并且具有较低的岩藻糖基化（45.3%）和唾液酸化（10.3%）。这种糖基化模式的差异可能影响抗体的生物学活性和免疫功能，从而在治疗效果上产生差异。在毒性和保护实验中，研究人员发现，基因工程小鼠产生的LXY-Ab在高剂量（100 mg/kg）下能够实现100%的生存率，而CHO系统表达的LXY-CHO在相同剂量下仅实现87.5%的生存率。这一结果表明，基因工程小鼠来源的抗体在中和SEB毒素方面表现出更强的保护能力，可能与其独特的糖基化模式和更高的结合亲和力有关。

在安全性方面，研究团队对基因工程小鼠进行了全面的组织病理学分析，结果显示，这些小鼠在主要器官（如心脏、肝脏、脾脏、肺部、肾脏和大脑）中均未表现出明显的病理变化。组织切片经苏木精-伊红（H&E）染色后，所有器官的结构和功能均保持正常，未出现因基因整合而引起的异常组织形态或功能障碍。这表明，ROSA26和H11作为基因组安全着陆位点，不仅能够支持高效的抗体表达，而且对宿主的生理功能没有负面影响。此外，研究人员还发现，尽管LXY-Ab在不同组织中表达水平存在一定的个体差异，但整体上其表达水平稳定，且在多个世代中保持遗传传递的准确性，这表明该方法在长期生产中具有较高的可行性。

研究还探讨了基因工程小鼠在抗体生产中的潜在应用。传统的单克隆抗体生产主要依赖于特定组织（如乳腺或卵白）的表达，这不仅限制了生产规模，还可能导致性别依赖性的问题，因为只有雌性动物能够提供目标产物。而通过基因组安全着陆位点的定点整合，研究人员成功实现了抗体在多个生物流体中的稳定表达，包括血清、乳汁和唾液，这大大拓宽了抗体的来源，并提高了生产效率。此外，该方法还避免了性别依赖，使得抗体生产可以适用于更广泛的动物群体，为未来的大规模生产提供了更多可能性。

在未来的应用方面，该研究提出了一种潜在的策略，即利用基因工程小鼠作为生物反应器，不仅用于生产治疗性抗体，还可能用于培育抗病的动物。例如，通过将针对特定病原体的抗体基因整合到动物基因组中，可以赋予这些动物对某些疾病的天然抵抗力，从而在畜牧业中具有重要的应用前景。此外，研究团队还指出，虽然当前的抗体产量（以mg/L为单位）仍低于乳腺特异性系统的g/L水平，但随着技术的不断优化，例如通过多安全着陆位点整合或复制数的增加，未来的产量有望进一步提升。

综上所述，这项研究不仅展示了基因工程小鼠作为生物反应器在治疗性抗体生产方面的潜力，还为未来的生物制药和疾病防控提供了新的思路。通过CRISPR/Cas9技术实现的定点整合策略，结合基因组安全着陆位点的使用，不仅提高了抗体的表达效率和稳定性，还确保了其功能的完整性。这一方法的建立，为大规模生产全人源抗体和开发抗病动物提供了重要的技术基础，同时也为生物制药领域带来新的发展机遇。未来的研究可以进一步探索该技术在其他病原体或病毒抗原的抗体生产中的应用，并推动其从实验室研究向实际生产转化。