针灸通过CGRP-RAMP1-TSP1通路调控巨噬细胞M2极化加速创面愈合的机制研究

《Chinese Medicine》：Acupuncture accelerates wound healing via CGRP-RAMP1-TSP1-mediated macrophage M2 polarization

本研究针对皮肤创面愈合中巨噬细胞表型调控机制不清的问题，通过建立小鼠全层皮肤缺损模型，探讨针灸如何通过CGRP-RAMP1-TSP1信号通路促进巨噬细胞M2极化。研究发现针灸能够显著加速创面愈合，改善胶原沉积质量，并通过激活CGRP-RAMP1-TSP1通路诱导巨噬细胞向M2表型转化，同时降低局部和系统性炎症因子IL-1β和IL-6水平。该研究为针灸促进组织修复的神经免疫机制提供了新证据，为慢性难愈性创面的治疗提供了新思路。

　　

皮肤作为人体最大的器官，是抵御外界环境威胁的第一道屏障。当这道屏障因创伤、切割或挫伤而破坏时，机体启动了一个经典的重叠性愈合程序，包括炎症期、增殖期和重塑期。在这个过程中，具有显著可塑性和持久性的巨噬细胞成为皮肤免疫微环境的中心调控者。它们能够响应细胞因子信号，极化为促炎（M1）或抗炎（M2）表型。M1巨噬细胞主要通过增强吞噬活性和分泌促炎细胞因子来清除病原体和细胞碎片，而M2巨噬细胞则通过抑制炎症和释放纤维化及血管生成介质来促进组织修复。因此，及时的M1向M2表型转换是决定愈合效率和质量的关键。

尽管针灸作为中医的重要组成部分，在镇痛、免疫调节和促进创面愈合等方面已显示出疗效，但其促进创面愈合的具体机制，特别是与巨噬细胞调控相关的机制，仍不清楚。尤其值得注意的是，针灸通过调节神经-内分泌-免疫（NEI）网络产生局部和全身效应，其中感觉神经元和皮肤细胞通过神经肽及其受体进行通讯，降钙素基因相关肽（CGRP）在这一过程中扮演着尤为关键的角色。研究表明，CGRP通过与中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞上的受体活性修饰蛋白1（RAMP1）相互作用，诱导血小板反应蛋白1（TSP-1）的表达，从而促进巨噬细胞向抗炎/促修复表型极化。虽然针灸已被证明能在多种组织中上调CGRP的表达，但CGRP在针灸加速创面愈合中的具体作用尚未完全阐明。

为了填补这一知识空白，Liu等人利用小鼠深层皮肤损伤模型，研究了针灸如何影响局部炎症和免疫细胞行为。研究人员通过在C57BL/6J小鼠背部制造8毫米全层皮肤缺损模型，并将它们随机分为对照组和针灸组。为了探究CGRP通路的作用，在每次针灸治疗前皮内注射CGRP受体拮抗剂BIBN4096。针灸组每天接受一次为期20分钟的干预，连续10天，方法是在伤口周围四个预定位置进行斜向手动针刺。通过组织学分析、流式细胞术、酶联免疫吸附测定、免疫荧光和逆转录定量聚合酶链反应等技术评估伤口修复质量、炎症细胞因子水平和巨噬细胞极化情况。

研究的关键技术方法包括：建立C57BL/6小鼠背部全层皮肤缺损模型；进行为期10天的围创面手动针灸干预；使用CGRP受体拮抗剂BIBN4096进行通路阻断；通过H&E和Masson染色进行组织形态学分析；利用流式细胞术分析脾脏免疫细胞比例；通过ELISA检测血清和局部组织中的炎症因子（IL-1β、IL-6）水平；采用免疫荧光和Western blot检测CGRP、RAMP1、TSP-1等关键蛋白的表达及定位；通过RT-qPCR分析M1/M2巨噬细胞标志物及相关信号通路分子的mRNA表达。

针灸加速创面愈合并提高愈合质量

研究结果显示，从治疗的第二天开始，针灸组的伤口面积就显著小于对照组。到第10天，虽然两组伤口面积没有显著差异，但苏木精-伊红（H&E）染色显示针灸显著促进了伤口上皮再生。免疫荧光和Masson染色进一步表明，针灸组伤口内的I型胶原比例更高，胶原纤维排列更紧密。这些结果说明针灸不仅加速了皮肤创面愈合，还提高了修复质量。

针灸减轻系统性炎症反应

作为核心免疫器官，脾脏在维持免疫稳态方面起着关键作用。实验结果显示，与对照组相比，皮肤损伤建模后第6天，小鼠脾脏体积和脾脏/体重比显著增加，而针灸治疗6天有效逆转了这些变化。流式细胞术分析显示，全层皮肤切口模型显著增加了脾脏中CD11b⁺F4/80⁺巨噬细胞和CD11b⁺Ly6g⁺中性粒细胞的比例，而针灸干预在第6天和第10天均显著降低了这两种细胞的比例。此外，血清中促炎细胞因子IL-1β和IL-6的水平也支持这些发现。这些数据表明，针灸能有效减轻皮肤损伤小鼠的系统性炎症反应。

针灸减轻损伤皮肤的局部炎症并诱导巨噬细胞M2极化

通过H&E染色评估免疫细胞浸润发现，针灸治疗显著减少了第6天和第10天损伤皮肤组织中的免疫细胞浸润。qPCR分析显示，针灸显著下调了局部损伤皮肤中TNF-α和CD86的mRNA表达，同时上调了IL-10和CD206的表达。免疫荧光染色使用F4/80作为泛巨噬细胞标志物，iNOS标记M1巨噬细胞，Arg-1标记M2巨噬细胞。结果显示，与模型组相比，针灸组M1巨噬细胞（F4/80⁺iNOS⁺）比例显著降低，M2巨噬细胞（F4/80⁺Arg-1⁺）比例显著升高，表明针灸促进局部巨噬细胞向M2表型极化。

针灸激活皮肤伤口中的CGRP/Ramp1/TSP-1通路

鉴于针灸能在多种组织中上调CGRP表达，研究人员假设针灸通过CGRP/Ramp1/TSP-1信号通路促进局部伤口愈合。创伤后第6天获取的小鼠皮肤组织样本测试结果显示，针灸显著增加了皮肤创伤组织中CGRP及其受体RAMP1的阳性染色和mRNA水平。正如预期，针灸组局部皮肤中TSP-1的表达也同步上调。Western blot检测进一步证实，针灸能在蛋白水平进一步上调CGRP和TSP-1的表达。这些结果表明针灸能激活皮肤伤口中的CGRP-Ramp1-TSP-1通路，这可能是其加速创面愈合的分子机制。

CGRP受体拮抗作用损害针灸加速的创面愈合

为了进一步验证CGRP/Ramp1/TSP-1通路在针灸加速创面愈合中的作用，研究人员在伤口边缘皮内注射CGRP受体拮抗剂（BIBN4096）。伤口面积量化分析显示，与盐水注射对照组相比，BIBN4096治疗组的伤口闭合显著延迟。H&E染色组织学检查表明，BIBN4096给药减弱了针灸的促愈合作用，表现为上皮再生延迟、毛囊新生减少、组织再生减弱以及真皮层炎症细胞浸润增加。此外，Masson三色染色和I型胶原免疫荧光染色表明，BIBN4096完全消除了针灸对愈合的有益影响，导致胶原沉积减少和皮肤再生延迟。

CGRP受体拮抗作用抑制针灸诱导的TSP-1表达和M2巨噬细胞极化

免疫荧光结果显示，针灸显著增加了盐水组中TSP-1阳性染色，而BIBN4096阻碍了针灸诱导的TSP-1表达上调。这一结论通过RT-qPCR和WB结果得到进一步证实。TSP-1的表达影响巨噬细胞的迁移和极化。研究人员观察到BIBN4096阻断了针灸下调皮肤伤口中M1标志物（iNOS、TNF-α和CD86）的能力，同时抑制了针灸诱导的M2标志物（Arg-1、IL-10和Mrc1）的上调。这些结果表明CGRP受体拮抗剂阻碍了针灸驱动的皮肤伤口巨噬细胞M2极化。值得注意的是，虽然BIBN4096显著提高了皮肤中局部促炎因子IL-1β和IL-6的水平，但针灸的抗炎作用并未完全消除。这一发现表明，除了激活CGRP-RAMP1-TSP-1通路诱导M2巨噬细胞极化外，针灸可能通过其他机制调节局部炎症微环境。

CGRP信号介导针灸的系统性抗炎作用

基于先前发现针灸改善全身和局部炎症，以及BIBN4096拮抗其对局部炎症的作用，研究人员通过局部皮内注射BIBN4096评估了CGRP-RAMP1-TSP-1通路在针灸系统性抗炎作用中的角色。研究发现BIBN4096不改变基线脾脏/体重比，但显著阻断了针灸诱导的该比值的降低。脾脏流式细胞术分析显示，BIBN4096增加了损伤后第6天巨噬细胞的比例，但第10天没有。更重要的是，BIBN4096阻断了针灸在第6天和第10天诱导的巨噬细胞比例减少。然而，BIBN4096对中性粒细胞表现出时间依赖性的矛盾效应。通过测量血液炎症细胞因子进一步研究系统性炎症状态发现，CGRP在神经免疫轴中的作用具有复杂性，它可能同时调节不同来源的炎症介质，并与针灸激活的其他通路动态相互作用。

该研究首次证实针灸通过激活CGRP-RAMP1-TSP1通路促进巨噬细胞M2极化并改善局部炎症微环境，从而加速皮肤创面愈合和组织重塑。这些发现为针灸介导组织修复的神经免疫机制提供了重要的分子见解。研究表明，针灸不仅加速了早期伤口闭合，还通过增强胶原沉积和形成更有序的纤维化结构提高了后期愈合质量。这些改善是由精确的免疫调节驱动的，针灸显著减轻了全身和局部炎症，表现为系统性炎症标志物减少、脾脏巨噬细胞浸润减少以及皮肤巨噬细胞向M2表型转变。

M2巨噬细胞被广泛认为是促修复细胞，表达一系列与愈合相关的因子。然而，引导巨噬细胞极化为修复表型的机制尚不完全清楚。新兴证据表明，通过RAMP1发出信号的神经肽CGRP在调节伤口愈合中发挥作用。为了确定CGRP-RAMP1-TSP1通路是否功能性地促进愈合，研究人员使用拮抗剂BIBN4096阻断了CGRP信号。由此产生的阻断抑制了TSP-1表达，延迟了伤口闭合，损害了组织修复，并减少了M2极化。这些发现表明，该通路对于介导针灸的促愈合益处是必要的，可能是通过驱动局部巨噬细胞表型转换。值得注意的是，虽然CGRP阻断消除了脾脏巨噬细胞数量的减少，但炎症因子的持续性降低仍然存在，这意味着CGRP非依赖性通路有助于针灸的系统性抗炎作用。

CGRP-RAMP1-TSP1轴的神经免疫调节功能可以通过使用CGRP受体激动剂或TSP-1激活剂在药理学上模拟。然而，基于CGRP的疗法的临床转化面临肽稳定性、控释和系统性副作用方面的挑战。此外，这种药理学策略缺乏针灸固有的动态、反馈响应性调节。针灸通过多层次神经回路整合体感信号，能够以最小的成本和侵入性协调调节炎症和组织修复。考虑到这些互补的特点，将针灸与靶向药理学激动剂结合可能是增强伤口愈合结果的有前景的综合策略。

该研究也存在若干局限性。首先，未检查CGRP-RAMP1-TSP1轴在非巨噬细胞系（如中性粒细胞）中的作用。其次，针灸降低血清炎症因子水平的机制（是通过减少生成、抑制释放还是其他过程）仍未解决，需要进一步研究。总之，该研究阐明了针灸通过CGRP-RAMP1-TSP1通路促进伤口修复的新机制，协调了局部和全身免疫反应。这项工作增进了我们对针灸神经免疫调节特性的理解，并为治疗难治性慢性伤口开辟了新途径。将传统针灸与现代神经免疫见解相结合，可能促进再生医学精准治疗策略的发展。