自噬依赖的内质网（ER）钙释放调节机制驱动KCNMA1/BKCa信号通路，并影响癫痫发作的易感性

《Autophagy》：Autophagy-dependent modulation of ER calcium release drives KCNMA1/BKCa signaling and seizure susceptibility

自噬通过调控内质网钙释放和 BKCa 通道活性影响神经元兴奋性，其缺失导致癫痫易感性升高。

　　神经元通过电信号进行交流，这些信号被称为动作电位。动作电位是在神经元轴突起始段产生的，然后沿着轴突的长度传播。当它到达轴突末端或突触前膜时，会触发神经递质储存囊泡与细胞膜的融合，从而释放神经递质。这些递质被突触后神经元的受体所接收，例如位于树突上的受体。神经元在刺激下产生动作电位的能力，称为内在兴奋性，主要依赖于细胞膜上的电压门控钠（NaV）和钾（KV）通道。动作电位的开始通常由NaV通道的开放引起，钠离子快速流入细胞，使膜电位迅速去极化。而动作电位的结束则由KV通道的开放导致，钾离子流出细胞，使膜电位恢复极化状态。这些通道的功能、表达或定位的异常，可能导致异常的电信号活动，从而引发兴奋性障碍，如癫痫。

虽然神经元自噬最著名的功能是清除容易聚集的蛋白质，从而对抗神经退行性疾病，但近期的研究也揭示了自噬在调节神经传递和行为中的作用。自噬可以在神经元的不同细胞器中局部进行，例如轴突、树突和突触，从而影响特定的神经功能，从神经递质释放到受体运输和兴奋性调控。相反，自噬功能的改变可能会导致癫痫的发生。这表明自噬不仅参与细胞质量控制，还参与神经信号动态调节。然而，目前对大脑自噬如何具体控制这些动态变化的细胞底物和机制仍知之甚少。

为了解决这一问题，我们使用了条件性敲除Atg5基因的小鼠（atg5 cKO），其中Atg5基因，即编码LC3脂化机制中一个关键成分的基因，在兴奋性神经元中被删除，从而阻碍了高效的神经元自噬。有两个观察结果促使我们关注兴奋性。首先，atg5 cKO小鼠在出生后表现出严重的生存能力下降。其次，Atg5的缺失使神经环路更容易被驱动至最大反应。这些发现促使我们测试自噬缺失是否会导致内在兴奋性的增加。在海马脑片中，我们使用了谷氨酸能激动剂——卡因酸（kainate），来驱动神经网络活动，并观察到atg5 cKO脑片中癫痫样爆发显著增加。为了进一步了解这一降低癫痫阈值的基础，我们从脑片中记录了截断轴突的刺激诱发电信号活动，从而将轴突特性与细胞体和突触分离。这些记录显示，轴突需要更少的刺激就能产生动作电位，这表明轴突的超兴奋性是导致atg5 cKO脑片中癫痫样爆发增加的主要原因。

基于这些结果，我们聚焦于内质网（ER），这是神经元内部的主要钙储存结构。此前的研究表明，神经元自噬的缺失会导致轴突内质网的积累，并增加钙通过RYR（ryanodine receptor）蛋白的释放。RYR是位于内质网膜上的大钙释放通道。在突触前膜，这种内质网钙稳态的变化促进了神经递质囊泡与细胞膜的融合，这一过程依赖于局部的钙浓度。在atg5 cKO脑片中进行的电生理记录显示，通过药物阻断RYR可以恢复突触前神经递质释放的增加，这表明异常的RYR介导的钙信号在增强突触前活动方面起着关键作用。令人惊讶的是，RYR的抑制不仅调节了突触前活动，还恢复正常了轴突兴奋性，从而降低了癫痫样爆发的倾向。这说明过量的内质网钙释放是导致这一表型的核心因素。

接下来，我们探讨了RYR介导的钙泄漏如何可能影响轴突兴奋性。一个重要的线索出现在我们对动作电位特征和形态的深入观察中。通过全细胞膜片钳记录，我们能够获得单个神经元内部的电信号，并研究动作电位的特性。这些记录显示，在atg5 cKO神经元中，动作电位的负斜率增加，或动作电位的半宽度减少，这表明突触后钾通道的功能得到了促进。令人惊讶的是，这一变化在RYR抑制后也得到了逆转，这说明RYR依赖的钙释放在塑造动作电位和轴突兴奋性方面起着重要作用。

结合这些观察，我们重点关注了一种特定的KV通道——大电导钙激活钾通道KCNMA1/BKCa。KCNMA1通道广泛表达，并在许多过程中发挥重要作用，包括神经元膜电位的复极化。它们被膜去极化和细胞内钙浓度的增加协同激活，因此在空间和功能上与钙源，如位于内质网的RYR耦合。我们假设增强的RYR介导的钙释放会导致KCNMA1活动的增加，从而导致观察到的超兴奋性表型。与这一假设一致，电生理测量显示，KCNMA1的抑制可以恢复atg5 cKO神经元中动作电位半宽度的减少，效果类似于RYR的抑制。此外，阻断KCNMA1通道可以显著减少卡因酸诱导的癫痫样放电，以及降低轴突的超兴奋性。相比之下，KCNMA1通道的抑制并未改变突触前神经递质释放的增加，这表明这一表型与KCNMA1无关。

自噬的缺失导致轴突内质网的积累，我们的研究结果表明，这种积累的内质网通过两种不同的以RYR为中心的机制扰乱了神经信号传递。首先，过量的内质网钙释放增加了突触前囊泡融合的概率，从而增强了突触传递。其次，同样的异常钙释放激活了KCNMA1通道，这使得动作电位的复极化更加迅速，增加了轴突的兴奋性。重要的是，这种KCNMA1功能的增强并非由于通道数量或分布的变化，因为定量蛋白质组学和免疫印迹分析显示KCNMA1或其他KV通道的水平没有改变。免疫标记进一步表明，尽管RYR在轴突中积累，KCNMA1的分布仍然保持不变，并且部分与RYR重叠，这与它们的功能耦合一致。综上所述，过量的内质网钙释放被认为是自噬缺失的核心后果。一个关键问题是，这种自噬在正常神经元生理中的调控作用是如何体现的。轴突中的钙对于神经递质释放、动作电位的塑造和突触可塑性至关重要，而自噬可能是调节这些过程的机制之一。自噬或内质网自噬与快速电信号之间的联系，为我们理解神经元如何控制其活动提供了新的视角，并揭示了自噬缺失如何导致癫痫样爆发的增加。