表征与控制非分裂人类细胞中CRISPR修复结果：揭示神经元编辑新机制

《Nature Communications》：Characterizing and controlling CRISPR repair outcomes in nondividing human cells

本研究针对非分裂细胞（如神经元）中CRISPR编辑结果难以预测和控制的问题，通过比较iPSC和iPSC衍生神经元对Cas9诱导DNA损伤的修复反应，发现神经元编辑结果积累缓慢且上调非经典DNA修复因子RRM2。通过药物抑制或siRNA干预RRM2等修复因子，可定向调控神经元、心肌细胞和原代T细胞中的插入/缺失突变（indel）分布，为精准基因治疗提供了新策略。

　　

基因组编辑技术CRISPR-Cas9为遗传病治疗带来革命性希望，但其临床应用仍面临重大挑战：细胞对DNA双链断裂（DSB）的修复结果难以预测和控制。这一挑战在神经元等非分裂细胞中尤为突出——这些细胞终生不再分裂，却需要维持基因组稳定性，而它们修复DNA损伤的机制与快速增殖的细胞截然不同。由于对非分裂细胞DNA修复机制的了解有限，CRISPR在神经系统疾病治疗中的效率和精准度受到严重制约。

为突破这一瓶颈，Gladstone研究所的Bruce R. Conklin团队在《Nature Communications》上发表了最新研究，通过比较人类诱导多能干细胞（iPSC）和iPSC衍生神经元对Cas9诱导DNA损伤的修复反应，揭示了非分裂细胞独特的修复机制，并开发了调控编辑结果的新方法。

研究人员首先建立了高效递送Cas9至神经元的技术平台。与分裂细胞不同，病毒样颗粒（VLP）能有效将Cas9核糖核蛋白（RNP）递送至人iPSC衍生神经元，诱导明显的DNA双链断裂。

研究发现神经元与分裂细胞的CRISPR编辑结果存在显著差异。在iPSC中，编辑结果在几天内达到稳定，主要产生与微同源介导末端连接（MMEJ）相关的大片段缺失；而在遗传背景相同的神经元中，编辑结果积累缓慢，持续长达2周以上，且主要产生与非同源末端连接（NHEJ）相关的小片段插入缺失突变（indel）。

机制研究表明，神经元中DNA损伤修复信号持续存在。免疫荧光染色显示，DNA双链断裂标志物γH2AX和53BP1的焦点在神经元中可检测至少7天。染色质免疫沉淀（ChIP）实验进一步证实，修复蛋白Mre11在切割位点附近的结合在转导后8天仍保持高水平。

有趣的是，神经元对Cas9-VLP的转录组反应与分裂细胞截然不同。RNA测序（RNAseq）显示，神经元在Cas9-VLP转导后显著上调DNA修复因子，特别是核糖核苷酸还原酶（RNR）的RRM2亚基——这一在分裂细胞中通常仅限于S期表达的基因在神经元中异常上调。

基于这一发现，研究人员通过药物抑制（如triapine/3AP）或siRNA敲低RRM2，成功改变了神经元中的编辑结果。RNR抑制使神经元indel分布从插入偏向删除，单碱基删除频率增加约3倍，总编辑效率提高约50%。这一效应在静止状态的原代人T细胞和iPSC衍生心肌细胞中也得到验证。

为拓展修复因子的调控范围，团队开发了"一体化脂质纳米颗粒（LNP）"，可同时递送Cas9 mRNA、sgRNA和靶向特定修复基因的siRNA。筛选发现，敲低RRM1、POLL或XRCC5可显著改变神经元和心肌细胞中的indel分布和效率。

该研究的关键技术方法包括：使用iPSC衍生神经元和心肌细胞作为非分裂细胞模型；通过病毒样颗粒（VLP）和脂质纳米颗粒（LNP）递送CRISPR组分；采用RNA测序分析转录组响应；通过染色质免疫沉淀（ChIP）评估修复蛋白结合；利用药物和siRNA干预修复通路；人类原代T细胞来自健康供体。

研究结果部分，VLP递送Cas9至人神经元部分证实，VSVG和/或BaEVRless（BRL）假型化的VLP能高效转导人神经元，效率高达97%。CRISPR修复结果在神经元与分裂细胞中的差异部分显示，神经元倾向于产生NHEJ相关的小indel，而iPSC主要产生MMEJ相关的大片段缺失。Cas9诱导indel在神经元中缓慢积累部分发现，神经元中indel积累持续至少16天，而iPSC中几天内达到稳定。DSB修复信号在神经元中持续存在部分证实，DSB标志物在神经元中可检测至少7天，Cas9蛋白在神经元中可持续存在30天。神经元对Cas9的转录响应部分揭示，神经元特异性上调DNA修复因子，特别是RRM2。RNR调控编辑结果部分证明，抑制RNR可改变indel分布，提高编辑效率。一体化LNP筛选修复因子部分展示，该平台能同时递送编辑工具和修复调控元件，加速基因失活。

研究结论强调，必须在相关细胞类型中测试基因组编辑疗法。神经元对Cas9诱导DNA损伤的独特反应导致修复结果显著不同，且编辑积累时间长达数周，这可能影响CRISPR疗法的安全性。幸运的是，通过操控神经元DNA修复通路，可提高基因组编辑的效率和精准度。研究不仅将神经元缓慢的indel积累从挑战转化为机遇，还开发了一体化颗粒，在递送Cas9的同时通过RNA干扰（RNAi）操控修复过程。通过在神经元、心肌细胞和原代T细胞中重现关键结果，证明了这些发现对未来基因组编辑疗法的重要意义。

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关键实验技术概要（约200字）：

研究采用iPSC衍生神经元和心肌细胞作为非分裂模型，通过病毒样颗粒（VLP）递送Cas9核糖核蛋白（RNP），脂质纳米颗粒（LNP）共递送Cas9 mRNA、sgRNA和siRNA。利用RNA测序（RNAseq）分析转录组响应，染色质免疫沉淀（ChIP）评估修复蛋白动态，通过药物（如3AP）和遗传干预（siRNA）调控修复通路。人类原代T细胞来自健康供体外周血单核细胞。