《Psychoneuroendocrinology》：Not All Saliva Samples Are Equal: The Role of Cellular Heterogeneity in DNA methylation and Epigenetic Age Analyses with Biological and Psychosocial Factors
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本研究利用529名儿童唾液DNA甲基化数据，比较成人及儿童参考面板在细胞类型比例估计中的性能，发现儿童参考面板更准确。通过分层分析，发现免疫细胞为主的样本中cotinine浓度对甲基化及甲基化年龄加速影响更显著，提示细胞类型差异对研究结果的影响。
Meingold H. Chan | Mandy Meijer | Sarah M. Merrill | Maggie P.Y. Fu | David Lin | Julia L. MacIsaac | Jenna L. Riis | Douglas A. Granger | Elizabeth A. Thomas | Michael S. Kobor
加拿大不列颠哥伦比亚大学医学院Edwin S. H. Leong健康老龄化中心，温哥华，BC省
摘要
唾液在生物医学群体研究中被广泛使用，包括表观遗传分析，以研究基因-环境相互作用并识别生物标志物。其微创采集方法使其非常适合用于儿科人群的研究。唾液是一种由免疫细胞和颊上皮细胞（BEC）组成的异质性组织。在众多表观遗传标记中，DNA甲基化（DNAm）是人类群体中最受研究的。DNAm谱型通常具有高度的细胞类型（CT）特异性。CT组成可以影响唾液中的DNAm与环境或健康状况的关联，以及表观遗传年龄加速（EAA），即基于DNAm得出的生物学年龄与实际年龄之间的差异。为了解决这个问题，基于参考值的CT解卷积和通过估计CT值进行统计调整已成为常见做法。然而，不同CT参考组（由成人样本或儿童样本构建）如何影响DNAm结果仍不清楚。此外，唾液中的DNAm和EAA关联主要源自免疫细胞还是颊上皮细胞，或者这些关联是否在CT比例不同的唾液样本中仍然存在，仍需要进一步研究。
本研究使用了来自529名儿童（平均年龄=7.26岁，标准差=0.26岁）的唾液DNAm样本，这些儿童来自一个基于社区的队列——家庭生活项目（Family Life Project）。我们的结果表明，基于儿童的参考组在拟合度方面优于基于成人的参考组，并强调了估计CT差异对DNAm关联的影响。当不考虑CT比例时，我们将唾液DNAm样本分为三个亚组——主要含颊上皮细胞、主要含免疫细胞以及两者混合的样本，发现各亚组之间的EAA存在显著差异。在DNAm和EAA关联的背景下，我们都发现烟草烟雾暴露生物标志物可替宁浓度在主要含免疫细胞的亚组中具有更强的影响。我们讨论了这些发现对涉及儿童唾液样本的表观遗传研究解释和重复实验的意义。
部分内容摘录
参与者
本研究使用了家庭生活项目（FLP）7年随访评估中收集的唾液样本。如之前所述（Vernon-Feagans, 2014），最初招募了1,292个家庭的代表性样本，这些家庭在母亲分娩时参与了研究。其中743个FLP家庭同意在7年随访时提供唾液样本进行分析。经过质量控制（QC）程序后，获得了529名儿童的DNAm数据（平均年龄=7.26岁，标准差=0.26岁，占比49.9%）
描述和比较成人和儿童唾液参考组中的CT比例估计及其作为协变量对EWAS结果的影响
首先，我们使用一个基于成人的参考组（Zheng等人，2018a）和一个基于儿童唾液的参考组（Middleton等人，2022；Fu等人，2025）来估计颊上皮细胞和免疫细胞的CT比例。我们的CT比例变量的前两个主成分（PCs）解释了90%的方差（成人：94.6%；儿童：97.2%），并被纳入EWAS模型中。有关统计分析的更多细节，请参见补充方法。分析代码将在后续提供
儿童参考组比成人参考组更适合估计儿童唾液中的CT比例
利用大量儿童的唾液样本，本研究探讨了与儿童唾液DNAm分析相关的几个基本问题（图1）。我们的初步重点是测试现有成人和儿童参考组在估计唾液中CT比例方面的表现。使用这两个参考组，我们发现颊上皮细胞的比例最高且变化最大（图2a；补充图S2）。估计的免疫细胞比例主要
讨论
本研究解决了在使用大量儿童唾液样本的EWAS和EAA关联背景下分析和解释高CT异质性唾液样本的DNAm发现所面临的挑战。利用唾液的高度异质性，我们通过分层方法研究了在DNAm和EAA关联中是否存在特定于CT类型的关联，同时调整了估计的CT比例
资助详情
本研究得到了“环境影响儿童健康结果”（Environmental Influences on Child Health Outcomes, ECHO）计划的支持，该计划由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）主任办公室资助，项目编号为7UH3OD023332-04；以及Eunice Kennedy Shriver国家儿童健康与人类发展研究所（Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development）的资助，项目编号为R01HD081252和P01HD039667。MC获得了加拿大卫生研究院（Canadian Institutes of Health Research, CIHR）的博士后奖学金（参考编号MFE-194003）的支持。MM获得了个人资助
CRediT作者贡献声明
Julia L. MacIsaac： 方法学、数据管理。
Lin Davia： 写作——审稿与编辑、方法学、数据管理。
Elizabeth A. Thomas： 写作——审稿与编辑、监督、方法学、概念构思。
Douglas A. Granger： 写作——审稿与编辑、监督、方法学、资金获取。
Sarah M. Merrill： 写作——审稿与编辑、研究、概念构思。
Mandy Meijer： 写作——审稿与编辑、方法学、研究、正式分析。
Jenna L. Riis： 写作——利益冲突声明
为确保完全披露，DAG是Salimetrics LLC和Salivabio LLC的首席科学和战略顾问，这些关系遵循约翰霍普金斯大学医学院和加州大学欧文分校的利益冲突委员会政策管理。所有其他作者均声明没有利益冲突。
致谢
我们感谢Kaitlin Smith、Hillary Piccerillo、Tatum Stauffer和Andrew Huang在唾液生物样本检测方面提供的技术支持。我们还要感谢所有参与这项研究的家庭、参与者以及教师们，以及家庭生活项目（FLP）的研究助理们的辛勤工作和奉献精神。本研究是家庭生活项目的一部分。我们也要感谢已故的Clancy Blair对家庭生活项目（FLP）的领导
