综述：用于视网膜神经节细胞活体成像的光学策略

《Med-X》：Optical strategies for in vivo retinal ganglion cell imaging

本综述系统梳理了适用于活体视网膜神经节细胞（RGC）成像的光学技术，对比了扫描激光检眼镜（SLO）、光学相干断层扫描（OCT）及双光子成像等结构成像技术，并探讨了多普勒OCT、视网膜血氧测定法及钙离子成像（如GCaMP）等功能成像技术在揭示RGC生理病理机制中的应用。文章还展望了设备小型化及人工智能（AI）驱动分析在加速临床转化方面的潜力，为视网膜神经病变的早期诊断和干预提供了重要见解。

　　

引言

全球有超过5.96亿人面临因视网膜疾病导致视力丧失的风险，其中许多疾病，如青光眼和糖尿病视网膜病变，都以视网膜神经节细胞（RGC）的变性和死亡为特征。RGC主要位于视网膜的神经节细胞层（GCL），其轴突形成视网膜神经纤维层（RNFL），负责将视觉信号从视网膜传递到大脑。RGC的功能依赖于视网膜血管丛的血液供应。在青光眼中，升高的眼内压（IOP）常导致RGC丢失和轴突变性，进而引发不可逆的失明。相比之下，糖尿病视网膜病变则源于血糖水平升高导致的视网膜微血管功能障碍，造成缺血环境，损害RGC的功能和存活。

由于这些神经退行性视网膜疾病发病隐匿，早期阶段常被忽视。据估计，超过一半的青光眼和糖尿病视网膜病变患者直到出现显著视力丧失时才意识到病情。因此，早期症状检测为预防或延缓神经病变进展提供了机会。视网膜因其易于接近的特性，成为非侵入性、高分辨率成像的理想靶点。结构成像模态，如扫描激光检眼镜（SLO）和光学相干断层扫描（OCT），能够在多个尺度上可视化视网膜的解剖特征，从完整的视神经头到单个神经元。另一方面，功能成像技术旨在通过分子标记和先进信号处理等间接方法量化视网膜的生理特性，例如多普勒OCT、成像引导的血氧测定法和荧光成像。

这篇综述讨论了光学视网膜成像的关键进展，重点介绍了它们的工作原理和应用。文章重点介绍了几种结构和功能光学成像技术，并深入探讨了能够达到可视化RGC所需分辨率的新兴技术。最后，讨论了在改进现有光学系统、结合机器学习以改善诊断以及成像技术转化潜力方面面临的持续挑战。

结构成像技术

多种结构成像模态被设计用于可视化视网膜多样的解剖特征，从视盘到单个RGC。虽然早期的视网膜成像形式在分辨细胞水平结构方面遇到困难，但研究努力一直集中在提高其空间分辨率、时间分辨率和对比度。细胞分辨率成像模态的出现使得能够量化神经元丢失并检测细微的形态学变化，如树突修剪和轴突变薄。这些生物标志物可以作为神经退行性变的早期指标，从而预测中枢神经系统疾病，如青光眼、帕金森病和阿尔茨海默病。

扫描激光检眼镜

SLO是一种活体视网膜成像技术，最早由R.H. Webb于1980年报道。它使用长相干长度的激光器，可根据应用需求在宽光谱范围内调谐。可见光范围内的波长更适合成像浅表视网膜组织（如RNFL），因为它们提供更高的空间分辨率。更长的近红外（NIR）光能更有效地穿透生物组织，使其在可视化更深层（如脉络膜循环）方面具有优势。在典型的SLO系统中，光束分束器将入射光引导至二维扫描器，后者以光栅模式平移光线扫描视网膜以获得所需的视场（FOV）。在共焦SLO中，从视网膜反射回来的光在到达探测器之前会通过一个针孔光圈。针孔阻止杂散光和离焦光到达探测器。通过只记录焦点内的反射光，最终图像的对比度和分辨率得到增强，从而更清晰地可视化目标结构。

SLO的一个常见应用是成像视盘，这是视网膜的一个血管区域，RGC轴突在此处离开眼睛。该区域包含中央视网膜动脉的入口点和中央视网膜静脉的出口点，它们为视网膜内层供应和引流血液以支持代谢需求。在一项研究小鼠视神经挤压（ONC）模型的纵向研究中，使用细胞分辨率SLO追踪RGC凋亡长达一个月。ONC是一种通过机械压迫视神经诱导局部轴突损伤的实验程序。该模型产生快速且可重复的RGC变性，使其成为研究视神经病变机制和评估潜在神经保护疗法的常用工具。基于其可视化群体水平变化的能力，SLO还支持对单个RGC进行纵向追踪，从而可以在疾病模型中分析细胞迁移。为了进一步比较模型间的疾病进展，还使用了共焦成像和分割技术来研究硅油诱导高眼压（SOHU）模型，该模型能更好地模拟青光眼的进行性和慢性特征。这些发现突显了SLO在活体单细胞追踪中的实用性，并展示了共焦显微镜如何通过确认结构差异来验证这些结果。

光学相干断层扫描

OCT于1991年首次推出，在眼科领域取得了重大突破，成为视网膜成像的“金标准”，每年执行约3000万次检查。其主要优势在于能够提供三维断层图像，从而可以重建涵盖更广泛深度的更全面图像。这种扩展的覆盖范围对于理解RGC与视觉通路中其他神经元（如提供兴奋性输入的双极细胞和通过抑制性信号调节其活动的无长突细胞）的相互作用至关重要。此外，提供断层图像的能力使得能够量化青光眼中的RNFL变薄、检测糖尿病视网膜病变中的黄斑水肿以及识别年龄相关性黄斑变性中的玻璃膜疣或地图状萎缩。

OCT的工作原理与超声成像类似。在其最简单的设计中，低相干光通过迈克尔逊干涉仪传输，干涉仪将光分成两路：样品臂和参考臂。在样品臂中，光通过眼睛瞳孔照射，产生一组从不同视网膜层反射回来的光束。类似地，光在参考臂中从镜面反射。当来自样品臂和参考臂的光重新组合时，在现代谱域（SD）-OCT和扫频源（SS）-OCT中会产生光谱干涉图。干涉图的k空间分布使得深度分辨成像成为可能。

虽然迈克尔逊干涉仪在OCT中常用，但一些系统采用马赫-曾德尔干涉仪，它也能支持平衡检测方案以提高信号质量并抑制噪声。平衡检测依赖于两个输出端口的干涉信号相位相差π，当信号相减时，可以有效消除共模噪声。迈克尔逊系统使用单个分束器的两个输出端口实现这一点，而马赫-曾德尔干涉仪使用两个分束器生成空间分离的互补信号。这种分离为管理光路长度提供了更大的灵活性，并促进了双光谱仪的使用。然而，权衡之处在于马赫-曾德尔干涉仪需要比更简单的迈克尔逊布局更仔细的对准和校准。

干涉图样的傅里叶变换对从视网膜特定位置反射的光强度进行编码，该位置的结构信息编码为A-line。对于点扫描OCT，入射OCT光束通过振镜扫描以成像感兴趣区域。一组A-line用于重建横截面图像，称为B-scan。通过在y方向合并多个B-scan，可以重建三维断层图像。x-y平面，称为en-face平面，提供视网膜的俯视图，类似于传统的眼底照相或SLO图像。

SD和SS系统能够以数MHz的速率扫描。SD-OCT通常采用宽带近红外超辐射发光二极管进行照明，中心波长通常在840 nm附近，并配合光谱仪进行检测。可见光OCT（vis-OCT）的最新发展表明，可见光范围内的光也可以集成到SD-OCT中，以获得更高的轴向分辨率图像。相比之下，SS-OCT采用可调谐激光器，该激光器快速连续地扫过一系列波长，并配合单光子探测器进行检测。就OCT设计而言，更长的波长能够实现更深的组织穿透和更少的散射，这非常适合可视化视网膜的更深层。相反，较短的波长导致更高的轴向分辨率，但散射增加，通常能提供视网膜表层之间更好的对比度。

OCT的一个突出应用是可视化和分析RGC轴突束，称为OCT纤维成像术。与目前追踪青光眼进展的标准方法——测量视网膜神经纤维层的整体厚度不同，OCT纤维成像术旨在量化单个轴突束的形态参数，如其宽度和横截面积。为了评估vis-OCT纤维成像术的准确性，一项单独研究比较了在转基因小鼠同一视网膜区域通过vis-OCT纤维成像术和荧光SLO图像测量的轴突束宽度。定量分析 across 30个束显示两种技术之间存在强线性相关性（R2 = 0.977），支持了vis-OCT纤维成像术用于活体测量单个RGC轴突束形态的可靠性。

各种数学模型，包括分形分析和Sholl分析，也被用于分析OCT纤维成像术中轴突的空间模式和连接性。分形分析通过计算分形维数来测量RGC轴突束组织的复杂性，该参数描述了结构在不同放大级别下呈现的错综复杂程度。Sholl分析则通过测量轴突束与以视神经头为中心的同心圆的交点数量来评估轴突束的空间分布，从而可以评估束密度随距离的变化。此外，信号采集方案如时间散斑平均（TSA）可用于增强图像的清晰度和分辨率，提供更高对比度的OCT纤维成像。

OCT纤维成像术已广泛用于动物模型中以检测视网膜神经退行性变的早期迹象。在小鼠中，它揭示了ONC后轴突肿胀和神经纤维束变薄，宽度、高度和横截面积的减少与进行性RGC胞体丢失相关。最近，对树鼩的研究（其垂直分层的神经纤维和分层的内丛状结构更接近人类视网膜）表明，OCT纤维成像术能够分辨亚层特异性变化，包括纤维分层的中断。这些发现支持将OCT纤维成像术作为一种有前景的工具，用于检测和监测人类青光眼等疾病。

双光子显微镜

近年来，双光子显微镜在RGC成像中越来越受到重视，与SLO相比，它具有对比度增强和信噪比高等优点。它依赖于组织内荧光团的双光子非线性激发，通过同时吸收两个能量较低的光子（在近红外光谱范围内）来实现。此外，相对于可见光谱，使用更长波长的照明减少了生物组织中的光学散射。典型的设置包括一个钛蓝宝石激光源，发射飞秒范围的超短脉冲，以及一个二向色镜来分离激发和荧光发射路径。

双光子和共聚焦显微镜光学设置最明显的区别之一是前者不需要针孔光圈。在共聚焦显微镜中，针孔对于拒绝离焦光至关重要。该机制通过选择性地允许从焦平面发射的光到达探测器来提高图像对比度。然而，在双光子显微镜中，荧光发射发生在吸收发生的特定飞秒时间帧内。由于这种限制，荧光激发只发生在特定的焦体积内，有效地完成了与针孔相同的任务。这种固有的深度限制减少了背景噪声，并在不牺牲信号强度的情况下增强了对比度。

双光子显微镜常与SLO结合使用，以增强活体RGC成像。SLO具有易于调节的视场（FOV）的优势，通常约为30度，对应小鼠视网膜约2毫米。双光子显微镜通过提供高达几百微米深度的光学切片来补充这一点，足以捕获视网膜内层并可视化精细的细胞结构，如神经纤维、小胶质细胞和RGC胞体。这些混合系统通过使用近红外波长来最大限度地减少光损伤，因为近红外光能量较低，光毒性效应更小。此外，非线性激发过程将激发限制在焦平面，避免了对周围组织的不必要暴露。

除了结合SLO和双光子显微镜外，许多当前的双光子视网膜成像系统还集成了一个电子可调透镜（ETL）与一个凹面偏移（CO）透镜配对，以实现轴向扫描。ETL通过向流体透镜施加电压诱导的压缩力F(V_d)来调制焦距，使其弹性膜变形并改变折射界面的曲率。此外，CO透镜向入射光束引入固定的发散度，有效地扩展了ETL的轴向调谐范围并改善了深度覆盖。这种配置允许在不同视网膜层（从RNFL和GCL到更深的结构如内核层INL）之间快速重新聚焦，而无需物理移动物镜。在一项研究中，通过三种方法量化了通过调节ETL实现的轴向位移：简化的近轴模型、详细的光线追迹Zemax模型以及使用荧光珠的直接实验测量。值得注意的是，由于小鼠晶状体的聚焦效应，眼睛内部实现的轴向位移比没有眼睛时测量的位移小约4倍。

最后，重要的是要注意自适应光学（AO）通常用于双光子视网膜成像系统中，以校正由角膜、晶状体和其他眼部组件引起的光学像差。结合AO后，双光子视网膜成像系统能够分辨相距仅几微米的细胞结构，如胞体和轴突。图5a显示了一种典型的像差传感器——Shack-Hartmann传感器的工作原理。当畸变的波前通过该传感器时，一组透镜let将原始光束的不同部分聚焦到电荷耦合器件（CCD）上，形成一组光点图案。通过分析这些光点与其理想位置的位移，传感器可以量化原始像差的位置。该信息随后被传递到可变形镜，后者动态调整其组件以通过调整光路长度来抵消像差。波前传感器和可变形镜共同形成一个由计算算法介导的闭环系统。

AO的效果可以通过比较双光子荧光显微镜获取的视盘图像来观察。在原始图像中，血管结构对比度降低，边缘显得不那么清晰，更精细的结构细节由于光学系统和眼睛引起的像差而模糊不清。然而，通过AO校正这些像差后，血管结构的清晰度显著提高。空间分辨率的增强通过点扩散函数的半高全宽（FWHM）的减小得到定量证明。该参数描述了集成AO的系统分辨两个紧密间隔物体的能力，有助于对接近衍射极限的结构进行精确测量。

d 会诱导压缩力 F(V_d)，使透镜膜变形并改变流体界面的曲率。曲率的这种变化改变了透镜的屈光力。GND：地。d 通过调整靠近物镜的ETL，可以可视化描绘不同视网膜层的各种横截面。RNFL：视网膜神经纤维层，GCL：神经节细胞层，IPL：内丛状层，INL：内核层。比例尺：20μm。面板b经ref.[111]许可改编。面板c经ref.[112]许可改编。面板d经ref.[34]许可改编。'>

功能成像技术

功能成像的主要目标是通过测量动态生理过程（如血流、代谢活动和神经反应）来扩展结构成像的临床应用。这种方法对于评估RGC的代谢消耗特别有价值，能够在可见结构损伤出现之前实现早期检测和干预，例如在青光眼中，功能损伤往往先于可见结构损伤。

血流动力学与视网膜氧代谢

通过先进的信号处理技术，OCT还可以测量生理参数，如血流和血氧饱和度。许多特殊形式的OCT已经被开发出来，以更好地理解眼睛的代谢需求和灌注特性。例如，OCT血管成像旨在通过区分血管和静态组织来增强血管区域的对比度。它依赖于移动血细胞产生的运动对比，并且无需外源性对比剂即可工作。另一方面，多普勒OCT可以提供关于眼部血流动力学以及各视网膜层弹性特性的定量信息。它测量信号所经历的多普勒频移，其中沿入射光方向的运动会导致背向散射信号中产生可检测的相位偏移，从而能够灵敏地测量沿入射光方向的血液流速。可见光OCT（vis-OCT）利用较短波长实现改进的分辨率，从而为血流提供更高的对比度。此外，氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白对可见光的差异吸收允许测量单个血管的血氧饱和度（sO₂）。一项研究通过使用vis-OCT量化遭受系统性缺氧的大鼠的血流和sO₂水平来例证这一点。在这项研究中，流速是通过将速度（v）乘以动脉或静脉的总横截面积（A）来计算的。此外，sO₂水平是通过测量作为波长函数的衰减系数来计算的，重建的OCT信号被拟合到一个方程中。

为了分析不同视网膜氧合状态的影响，后续研究采用这些方法记录了大鼠在经历交替的常氧、缺氧和高氧时期的sO₂水平。相应数据显示从动脉到静脉的氧合作用发生显著变化，其中静脉变化最大，范围从缺氧时的50%到高氧时的85%。相比之下，毛细血管sO₂变化小于10%，表明毛细血管水平的氧交换受到严格调控。由于毛细血管在RGC所在的视网膜内层最为丰富，这种稳定性确保了为这些细胞的高代谢需求提供一致的氧气供应。同时，较大的静脉波动可能反映了整个视网膜累积的氧交换。这种动态调节有助于识别青光眼和糖尿病视网膜病变等疾病中导致RGC损伤的缺氧应激或代谢功能障碍，并可能作为评估保护性疗法的生物标志物。

神经活动

荧光成像是研究视网膜神经活动的强大工具，可提供对细胞凋亡、氧化应激和能量代谢等过程的见解。一个主要应用是检测RGC凋亡，这是神经功能障碍和变性的关键标志。对于活体应用，细胞凋亡特异性探针被设计用于选择性标记垂死的RGC，而不干扰健康细胞的活动。其中一种探针capQ整合了一个细胞穿透性Tat肽、一个蛋白酶识别序列和一个近红外荧光团。当capQ在活跃细胞中保持光学惰性时，其荧光团仅在由经历程序性细胞死亡的RGC分泌的caspase-3和caspase-7等蛋白酶切割时被激活。这种选择性激活使得能够实时可视化神经变性。其他工具包括基于膜联蛋白V的荧光标记物，它与早期凋亡过程中外化的磷脂酰丝氨酸残基结合；以及线粒体膜电位敏感性染料，如JC-1或四甲基罗丹明乙酯，可通过识别线粒体功能破坏来检测凋亡的早期阶段。这些多样的探针已在青光眼动物模型中针对已建立的识别凋亡RGC的方法（如TUNEL assay）进行了验证。

另一种广泛使用的荧光成像技术是钙成像，它记录钙离子（Ca²⁺）敏感性荧光指示剂的响应，作为细胞活动（如神经元放电或突触传递）的代理。此类指示剂的一个例子是GCaMP，它是一种嵌合体，由三个亚结构域组成：绿色荧光蛋白（GFP）、钙调蛋白和源自肌球蛋白轻链激酶的肽链。在光刺激感光细胞时，突触输入会升高RGC内的细胞内Ca²⁺，导致钙调蛋白结构域发生结合相互作用。这种结合诱导构象变化，导致GFP发射510 nm的光。在最近的一项研究中，使用活体GCaMP介导的钙成像比较了ONC和青光眼模型小鼠RGC的ON/OFF活动。ON状态指的是RGC在光开始时增加其放电频率，而OFF状态在光强度降低时被激活。尽管ONC和青光眼模型中都存在眼压升高和视神经损伤，但观察到病理机制存在显著差异。此外，GCaMP信号显示ONC模型中存活RGC迅速下降。相比之下，青光眼模型中的细胞经历了较慢的变性过程，八周后仍有显著数量的细胞存活。总体而言，这项研究证明了基于GCaMP的钙成像如何阐明不同的RGC功能状态，揭示了ONC作为青光眼病理模型的不足之处。

钙成像也是一种评估RGC对外部模式刺激反应的有效方法。在一项研究中，使用ChrimsonR（一种红移通道视紫红质）来研究活体灵长类动物中央凹RGC的激活。ChrimsonR作为一种光遗传学 actuator，使得能够通过光刺激控制神经元活动。通过将ChrimsonR与钙指示剂GCaMP6s共表达，研究人员使用AO-SLO在模式光刺激期间监测钙内流。当暴露于功率为12.5 mW/cm2的0.2 Hz模式光栅刺激时，表达ChrimsonR的RGC表现出显著的Ca²⁺内流。为了验证光遗传学激活，将中央凹环分为两个区域。使用高强度730 nm飞秒激光消除上区域的光感受器输入，而下区域保持完整。随后的闪烁光刺激，以足以激活光感受器但低于光遗传学阈值的强度传递，仅在完整区域产生周期性响应。然而，在针对ChrimsonR的较高强度下，在受损的光感受器区域检测到光遗传学Ca²⁺内流，证实了直接的RGC激活。

最后，钙成像可用于研究神经活性药物（如钠和钾通道阻滞剂）的药效学，重点关注其作用机制、量效关系和时间进程。最近一项研究开发了一种带有AO的双光子荧光显微镜，以观察小鼠在向非成像眼球后注射10μL 2%利多卡因后RGC活动的变化。利多卡因是一种局部麻醉剂，通过阻断钠通道来抑制神经传导和疼痛信号传递。它常用于眼科手术中麻醉眼睛。该研究发现，注射利多卡因会导致RGC的相对荧光迅速下降，表明钠通道被阻断并抑制了动作电位的产生。荧光强度在一分钟内恢复到基线水平，证实利多卡因的剂量有效地抑制了神经活动。

2数据。该数据可用于量化血液在视网膜内从动脉流向静脉时氧饱和度的变化。c capQ复合物特异性结合死亡RGC释放的caspase，激活其NIR荧光团。d GCaMP是另一种在钙存在下激活的荧光复合物。e 钙成像的一个应用是评估RGC响应光感受器输入的活动。比例尺：150μm。f 钙成像还可以评估由利多卡因诱导的细胞药物反应。比例尺：50μm。面板e经ref.[132]许可改编。面板f经ref.[51]许可改编。'>

系统集成与临床转化

优化视网膜成像设备和推进计算技术加速了活体RGC成像的临床采用。手持式和紧凑型成像系统解决了与运动伪影和患者可及性相关的长期挑战。同时，新颖的光学方法，如双光子显微镜，扩展了诊断和治疗能力。与此同时，机器学习已成为自动化视网膜结构和疾病分析的宝贵工具，设计了用于分割RGC图像和分类病理的算法。

设备优化

紧凑型和手持式成像平台解决了传统系统的固视挑战，使RGC和光感受器成像对于婴儿、幼儿和行动障碍者更具可及性。一种提高便携性的策略是用微机电系统（MEMS）扫描仪取代传统的基于振镜的扫描仪，这是一种使用微镜通过静电、电磁或压电驱动来操控光束的紧凑设备。儿科人群的临床试验和动物模型研究已证明，手持式OCT平台可以减少运动伪影，同时实现精细至4.5μm的轴向分辨率，即使在有不自主眼动的患者中也能精确测量从神经节细胞层到视网膜色素上皮层等不同视网膜层的厚度。

设备优化的另一个方向是将双光子显微镜集成到现有的临床SLO、OCT和眼底成像系统中，以促进诊断和治疗干预。尽管当前的双光子研究主要局限于动物模型，但多个早期临床试验已经在进行中，应用范围从干细胞衍生RGC的移植到RGC凋亡的量化以及激光引导的显微手术。一项研究显示，飞秒激光消融可以触发生物组织内新型荧光分子的产生，有效地充当体内标记剂。这些化合物表现出独特的光谱和时间荧光特性。在后续研究中，这些特性被用于在激光轴突切断术（一种精确切断轴突的技术）过程中实时描绘消融边界，该技术也被证明可以刺激视网膜神经再生、促进血管生成并促进血凝块消散。

机器学习整合

近年来，机器学习在眼科成像和现代医学中迅速获得发展势头，指导视网膜神经病变的检测、诊断和治疗。许多图像分类算法已经设计并使用公开可用的SLO或OCT数据集进行测试，以自动化分割、细胞计数和分类等任务。为了评估这些模型的性能，可以计算受试者工作特征曲线下面积（AUROC）等参数。视网膜成像中机器学习的一个例子是一项研究引入的RETFound，这是一种自监督基础模型，在超过160万张视网膜图像上进行了预训练，并针对