促红细胞生成素及其受体在开放性脊柱裂中的神经保护作用：大鼠模型受体表达与体外神经前体细胞保护机制研究

《Child's Nervous System》：Neuroprotective properties of erythropoietin (Epo) and its receptor (EpoR) in open spinal dysraphism (OSD): an investigation of EpoR expression in a rat OSD model, along with in vitro studies on the neuroprotective effects of Epo on rat spinal cord-derived neural progenitor cells

本研究针对开放性脊柱裂(OSD)手术修复后神经功能损伤难题，探索了促红细胞生成素(Epo)及其受体(EpoR)的神经保护潜力。通过大鼠OSD模型发现EpoR在神经基板中显著上调，并证实Epo能有效逆转人工羊水(aAF)对神经前体细胞(NPCs)的增殖抑制和分化障碍，其作用机制涉及JAK2/STAT5/Akt信号通路。该研究为OSD的辅助神经保护治疗提供了新靶点。

　　

在胎儿医学领域，开放性脊柱裂(Open Spinal Dysraphism, OSD)始终是导致儿童残疾和死亡的主要先天性疾病之一。虽然胎儿外科手术技术的进步显著改善了患者的运动功能预后，但长期随访数据显示，许多患者仍面临严重的神经功能障碍。这提示单纯依靠手术修复结构缺陷，难以完全阻断疾病进展中的继发性神经损伤。根据"二次打击"理论，暴露的神经组织在羊水中持续受到毒性物质侵蚀和机械性损伤，是导致神经功能恶化的重要机制。因此，探索能够补充手术治疗的神经保护策略，成为改善OSD预后的关键研究方向。

在这一背景下，促红细胞生成素(Erythropoietin, Epo)及其受体(Erythropoietin receptor, EpoR)引起了研究人员的注意。Epo作为一种临床上广泛应用于新生儿缺氧性脑病治疗的细胞因子，其强大的神经保护特性已在多种神经系统疾病模型中得到证实。然而，Epo在OSD中的潜在价值尚未被系统探索。本研究通过整合体内外实验，首次系统评估了Epo/EpoR系统在OSD病理过程中的表达特征和功能作用。

为了开展这项研究，研究人员采用了多学科交叉的实验策略。在体内实验部分，团队使用了维甲酸(Retinoic acid, RA)诱导的大鼠OSD模型，这是研究脊柱裂发病机制的经典动物模型。通过这一模型，研究人员在胚胎期第16天(E16)、E18和E22三个时间点，系统分析了OSD神经基板中Epo和EpoR的表达动态。在体外实验部分，研究从成年Long Evans大鼠脊髓中分离培养了神经前体细胞(Neural Progenitor Cells, NPCs)，并建立了人工羊水(artificial Amniotic Fluid, aAF)刺激体系，模拟OSD中神经组织暴露于羊水的病理环境。这一创新的实验设计使研究人员能够直接观察aAF对神经细胞的毒性作用，以及Epo的潜在保护效应。

EpoR表达及解剖定位在OSD大鼠模型来源的神经基板中的研究结果

通过qRT-PCR检测发现，EpoR mRNA在OSD神经基板中的表达从E18开始显著升高，到E22时达到峰值，而Epo本身的mRNA水平则未见显著变化。同时，缺氧诱导因子Hif-2α（而非Hif-1α）的mRNA水平在OSD组织中也显著上调，提示缺氧相关机制可能参与了EpoR的调控。

免疫组织化学分析进一步揭示了EpoR蛋白的空间分布特征。在正常脊髓组织中，EpoR免疫阳性细胞主要分布于背角、腹角、神经节以及E16时的中央管室管膜层。在OSD神经基板中，除了上述区域外，E18和E22时在基板外层（基质区，对应正常中央管结构）也出现了明显的EpoR表达。

通过双标免疫荧光技术，研究人员发现EpoR与早期神经元标志物β-III-微管蛋白(β-III-tubulin)、成熟神经元标志物NeuN以及神经前体细胞标志物Musashi1存在共定位，表明EpoR主要表达于神经元谱系细胞。同时，EpoR与Hif-2α的共标实验进一步支持了缺氧信号通路可能参与调控OSD中EpoR的表达。

aAF对NPCs增殖和细胞死亡率的影响

体外实验结果显示，aAF对NPCs表现出浓度依赖性的毒性作用。30%和55%的aAF能够抑制NPCs的增殖，而80%和100%的aAF则导致细胞数量显著减少。细胞毒性实验进一步证实，55%和80%的aAF处理从第1天开始就引起细胞死亡率显著升高，且这种效应随时间推移而加剧。到第8天时，80% aAF处理组的细胞死亡率达到对照组的6倍，55% aAF处理组为3.5倍。

Epo对aAF诱导的NPCs效应的影响

在aAF毒性模型基础上，研究人员评估了Epo的神经保护作用。结果显示，单独使用Epo对未受aAF处理的NPCs死亡率没有影响，但当与55% aAF共同处理时，Epo能够显著缓解aAF引起的抗增殖效应，并将细胞死亡率维持在低于或相当于未处理对照组的水平。

Epo和aAF对NPCs细胞标志物mRNA表达谱的影响

基因表达分析发现，aAF处理导致NPCs中前体细胞标志物（如Musashi1）和神经元标志物（如β-III-微管蛋白、MAP2）的mRNA表达下调。而加入Epo后，这些标志物的表达呈现出向未处理对照组水平恢复的趋势，表明Epo可能有助于维持NPCs的分化潜能。Western blot实验进一步证实，Epo的保护作用是通过激活JAK2/STAT5/Akt信号通路实现的，因为通路抑制剂AG490能够显著减弱Epo的效应。

研究结论与讨论部分强调，本研究首次证实了OSD神经基板中EpoR表达上调的现象，并通过体外实验证明了Epo对aAF诱导的神经毒性具有保护作用。Epo能够缓解aAF引起的NPCs增殖抑制和细胞死亡，并通过JAK2/STAT5/Akt信号通路发挥作用。这些发现为将Epo作为OSD手术辅助神经保护治疗提供了实验依据。

从临床转化角度，研究人员提出了一些前瞻性的应用思路。鉴于Epo在新生儿临床应用中已显示出良好的安全性，将其用于OSD的辅助治疗具有可行性。特别是考虑到OSD病变区域的直接可及性，在外科手术过程中局部应用Epo可能是一种有效的给药策略。结合组织工程支架或水凝胶技术，开发能够持续释放Epo的植入材料，可能为OSD患者提供更加优化的综合治疗方案。

当然，本研究也存在一些局限性。使用的aAF成分是基于妊娠22周羊水的平均浓度配制的，未能充分考虑妊娠不同阶段羊水组成的变化。此外，EpoR在神经基板中的具体调控机制仍需进一步阐明。未来的研究需要更深入地探索Epo/EpoR系统在OSD病理过程中的作用机制，以及与其他信号通路的交互作用。

这项发表在《Child's Nervous System》上的研究为OSD的综合治疗提供了新的思路。通过证实Epo/EpoR系统在OSD中的表达特征和功能作用，研究为开发针对这一严重先天性疾病的新型神经保护策略奠定了重要基础。随着进一步的研究验证，Epo有望成为OSD手术修复的重要辅助治疗手段，最终改善患者的长期神经功能预后。