通过整合生物信息学分析识别与神经营养因子相关的生物标志物，并深入探讨神经病理性疼痛的机制

《ACS Omega》：Identification of Neurotrophic Factor Related Biomarkers and Mechanistic Insights into Neuropathic Pain via Integrated Bioinformatics Analysis

神经退行性疼痛（NPP）的分子机制及生物标志物研究。通过整合单细胞RNA测序、生物信息学分析和分子对接技术，鉴定了Myo10、Rhoq、Sema6a、Spata13和Id4五个与NPP相关的生物标志物，揭示了其通过调控细胞间通讯、免疫微环境和关键信号通路（如线粒体磷酸化、p53信号通路、神经活性配体-受体相互作用）参与疾病发生发展的机制，并发现Myo10与药物性神经病变及Sema6a与腰腿痛存在潜在因果关系。

　　神经病理性疼痛（NPP）是一种由感觉神经系统损伤或疾病引起的广泛性疼痛综合征，其发病机制复杂，治疗难度大。目前，尽管已有大量研究探讨了神经营养因子（NTFs）在NPP中的关键作用，但针对具有诊断潜力的神经营养因子相关基因的识别以及治疗靶点的探索仍存在明显不足。因此，进一步深入研究NPP的分子机制变得尤为重要。本研究通过整合生物信息学方法，旨在识别与NPP相关的关键生物标志物，并探索其潜在的分子机制，为未来NPP的诊断和治疗提供新的思路。

神经营养因子是一类对神经系统发育、存活、功能和修复至关重要的蛋白质分子。它们通过与特定受体结合，调节神经细胞的生长、分化、存活和可塑性，在神经系统发育和功能维持中发挥着重要作用。常见的神经营养因子包括脑源性神经营养因子（BDNF）、神经生长因子（NGF）、神经生长因子-3（NT-3）、神经生长因子-4/5（NT-4/5）以及胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）。其中，BDNF主要在大脑中合成，对神经元的生长、发育和存活具有重要作用，能够改善神经元的病理状态，防止神经元损伤和死亡，并促进受损神经元的再生和分化。三叉神经痛（TN）是影响患者面部的严重神经病理性疼痛疾病之一，三叉神经节（TG）作为三叉感觉通路的外周神经节，包含多种感觉神经元和卫星神经胶质细胞（SGCs）。BDNF和GDNF是TG神经元中合成的两种重要神经营养因子，被认为是与神经传导和NPP发生密切相关的重要分子。研究表明，BDNF能够调节三叉神经的中枢痛觉传递，而GDNF则与外周疼痛的调节密切相关。带状疱疹后神经痛（PHN）是一种由水痘-带状疱疹病毒（VZV）再激活引起的慢性NPP综合征。研究发现，在PHN过程中，外周神经系统中的背根神经节（DRG）神经元会合成BDNF并将其运输回脊髓的终末。在NPP发生时，BDNF的合成和释放显著增加。尽管已有大量研究探讨了NTFs在NPP中的关键作用，但仍然缺乏对具有诊断潜力的神经营养因子相关基因的系统识别，以及对治疗靶点的深入探索。因此，进一步研究NPP的分子机制具有重要意义。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术能够实现对基因组的全面分析，揭示细胞异质性，并明确不同组织中每种细胞类型的状态和功能。在本研究中，我们利用scRNA-seq技术分析了小鼠DRG中的细胞变化，并结合转录组数据识别了与神经营养因子相关的生物标志物。此外，我们还通过免疫微环境分析，探讨了这些生物标志物在NPP中的作用及其潜在的因果关系。细胞间通讯分析和伪时间分析进一步揭示了关键细胞群体之间的相互作用及其在疾病发展过程中的分化轨迹。通过这些方法，我们成功鉴定了五种与神经营养因子相关的生物标志物：Myo10、Rhoq、Sema6a、Spata13和Id4。这些生物标志物的发现不仅有助于深入理解NPP的分子机制，还为未来NPP的诊断和治疗提供了新的靶点。

为了进一步揭示这些生物标志物在NPP中的作用，我们进行了基因-基因相互作用（GGI）网络构建和富集分析。结果显示，这些生物标志物涉及多个关键的生物过程，包括核糖体、p53信号通路、氧化磷酸化、神经活性配体-受体相互作用等。其中，Myo10在核糖体、p53信号通路和致病性大肠杆菌感染等通路中显著富集；Rhoq则在核糖体、致病性大肠杆菌感染和蛋白酶体等通路中表现出显著的富集；Sema6a则与核糖体、p53信号通路和磷脂酰肌醇信号系统相关；Spata13主要与神经活性配体-受体相互作用、核糖体和蛋白酶体相关；而Id4则与帕金森病、氧化磷酸化和阿尔茨海默病等疾病相关。这些发现表明，这些生物标志物可能通过调节多种关键的生物过程参与NPP的发生和发展。

为了系统揭示这些基因在疾病状态下表达失调的上游转录后调控机制，我们构建了一个包括miRNA和lncRNA在内的上游调控网络。通过预测分析，我们发现Myo10与16种miRNA相关，Rhoq与4种miRNA相关，Sema6a与11种miRNA相关，Spata13与8种miRNA相关，而Id4则没有预测到相关的miRNA。基于这些miRNA，我们进一步鉴定了10种lncRNA，成功构建了一个由48个节点和57条边组成的mRNA-miRNA-lncRNA调控网络。该调控网络揭示了这些关键生物标志物可能受到复杂的非编码RNA网络的调控。值得注意的是，一些重要的调控关系包括Myo10与mmu-miR-124–3p-Meg3之间的相互作用，以及Rhoq与mmu-miR-26b-5p-Gas5之间的相互作用。其中，长非编码RNA Meg3和Gas5可能通过结合相应的miRNA，从而缓解其对目标基因Myo10和Rhoq的抑制作用，最终导致这些基因在疾病状态下的表达上调。这种ceRNA调控机制可能是NPP发生和发展的重要驱动因素。

为了进一步探讨这些生物标志物与化学化合物之间的相互作用，我们通过比较毒理基因组数据库（CTD）预测了与这5种生物标志物相关的55种化合物，并构建了一个mRNA-药物调控网络。随后，我们对每个表现出“增加反应”效应的生物标志物进行了分子对接分析。结果显示，ID4与CGP 52608结合，结合能为-4.1 kcal/mol；MYO10与aflatoxin B2结合，结合能为-8.9 kcal/mol；RHOQ与bisphenol A结合，结合能为-5.9 kcal/mol；SEMA6A与Benzo(a)pyrene结合，结合能为-8.5 kcal/mol；SPATA13与Estradiol结合，结合能为-7.7 kcal/mol。总体而言，大多数配体表现出较强的结合活性（结合能≤-5 kcal/mol），而ID4的结合能为-4.1 kcal/mol，表明其结合能力相对较弱。这些结果不仅为理解这些生物标志物的潜在治疗作用提供了线索，也为未来NPP的靶向治疗策略提供了新的方向。

为了进一步探讨这些生物标志物与NPP之间的因果关系，我们进行了孟德尔随机化（MR）分析。MR分析基于三个核心假设：（1）遗传变异（IVs）必须与暴露因素（如生物标志物的基因表达水平或蛋白丰度）有强相关性；（2）IVs不应与结局（NPP）有任何已知的混杂因素相关；（3）IVs只能通过影响暴露因素间接影响结局，且不应存在其他直接或间接的生理通路。在本研究中，我们选取了与生物标志物显著相关的SNPs作为IVs，并通过MR-Egger、加权中位数、逆方差加权（IVW）、简单模式和加权模式等多种方法进行分析。其中，IVW方法在识别因果关系方面表现出较高的效率，并且揭示了生物标志物与NPP之间的显著统计学关联（P<0.05）。敏感性分析进一步验证了这些发现的可靠性，异质性和水平多效性测试显示P>0.05，表明没有显著的异质性或水平多效性。此外，通过逐步排除每个SNP，我们发现剩余SNPs对结局变量的影响变化较小，进一步支持了MR分析结果的稳健性和稳定性。

细胞间通讯分析揭示了不同细胞类型之间的相互作用模式。研究结果表明，在疾病组中，SGCs与淋巴细胞之间的相互作用数量和强度均显著增加（通讯强度=0.43）。随后，我们选择了SGCs作为关键细胞进行伪时间轨迹分析。结果显示，state1细胞主要分布在早期分化阶段，而state6细胞则主要分布在晚期分化阶段。此外，生物标志物在晚期分化阶段表现出显著的高表达水平。这些发现不仅揭示了SGCs在NPP中的重要性，还进一步说明了生物标志物在细胞分化过程中的动态变化。

在讨论部分，我们探讨了这些生物标志物在NPP中的潜在作用机制。SGCs作为感觉神经元细胞体周围的胶质细胞，在NPP和神经再生过程中发挥着重要作用。通过scRNA-seq分析，我们发现NPP模型中SGCs的比例显著下降，这与传统的激活理论有所不同。这种差异可能反映了不同疾病阶段或亚型的异质性机制。早期激活可能随着疾病进展演变为功能耗竭或凋亡，或者可能表明存在一种以胶质细胞减少为特征的NPP亚型。这一结果促使我们重新审视SGCs在疼痛中的作用，其功能状态（如激活或减少）可能比绝对数量更具病理学意义。未来的研究需要更精确的细胞谱系追踪和功能验证，以进一步阐明这一现象的具体机制。

Myo10是肌动蛋白结合蛋白家族的一员，在细胞膜突起、细胞迁移、内吞作用和信号传导等多种细胞活动中发挥重要作用。已有研究表明，Myo10在调节细胞骨架和通过调控丝状伪足形成影响细胞迁移中起关键作用。此外，Myo10还通过影响SHH/WNT信号通路和N-钙粘蛋白介导的细胞粘附，参与神经元的迁移和功能活动。尽管目前尚缺乏直接证据表明Myo10在NPP中的作用，但考虑到其在神经元分化和神经网络形成中的重要作用，我们推测Myo10可能通过调节神经元-胶质细胞的相互作用参与NPP的发病机制。值得注意的是，本研究首次发现了Myo10与药物诱导性神经病变之间的显著因果关系，表明Myo10可能具有降低药物诱导性神经病变风险的潜力。这一发现为进一步探讨Myo10在NPP中的潜在作用提供了新的视角。

Rhoq（也称为TC10）是Rho家族GTP酶的重要成员，参与细胞骨架重塑、细胞极性和囊泡运输等过程，对神经系统发育和损伤修复起着关键作用。现有研究表明，Rhoq通过调控微管稳定性及膜运输过程，参与轴突再生。Koinuma等研究发现，Rhoq通过PAK2-JNK信号通路调控微管相关蛋白如SCG10和MAP1B的磷酸化，从而影响轴突生长和再生。本研究首次发现Reelin-Rhoq信号轴在DRG神经元轴突再生中的作用，不仅突显了Rhoq在外周神经系统损伤修复中的核心地位，也为理解其在NPP中的作用提供了重要线索。总体而言，Rhoq可能通过调节DRG神经元的细胞骨架重塑和影响损伤后轴突再生过程中的异常神经支配，参与NPP的病理过程。尽管目前尚未有直接证据表明Rhoq在NPP中的作用，但其在神经系统损伤修复中的关键作用以及本研究中发现的显著表达变化，表明Rhoq可能是NPP的重要分子节点。

Sema6a是跨膜Semaphorin家族的一员，通过与PlexinA2/A4受体的相互作用，参与神经系统发育中的关键过程，如轴突导向、神经元迁移和突触形成。这些功能特性使其有可能通过多种机制参与NPP的发生和发展。已有研究表明，Sema6a在视网膜神经节细胞的层状排列、胼胝体投射形成以及皮质脊髓束轴突导向中起关键作用，表明其在DRG发育和功能中的潜在重要性。具体而言，Sema6a可能通过调控DRG神经元的细胞骨架重排和轴突导向，直接影响伤害性信号的传导效率。此外，Sema6a介导的神经元-胶质细胞相互作用，如与放射状胶质细胞的排斥信号，可能参与疼痛相关神经回路的异常重塑。特别值得注意的是，Sema6a缺乏导致视网膜神经节细胞的异常投射，提示类似机制可能参与伤害性传导通路，而Sema6A-PlexinA2/A4信号通路在神经元迁移终止过程中的异常激活可能与神经损伤后的疼痛传导有关。这些发现不仅扩展了我们对Sema6a在神经系统中的作用的理解，还为基于Sema6a信号通路的新型镇痛策略提供了重要的理论基础。

Spata13（Asef2）是Rho家族的鸟苷酸交换因子（GEF），在调控细胞骨架动力学和细胞迁移中发挥核心作用。它通过激活Rac1和Cdc42等小GTP酶，精确调控肌动蛋白-肌球蛋白收缩性和细胞粘附动力学。这一机制在神经元迁移、突触形成和神经回路重塑等关键过程中起着重要作用。值得注意的是，Spata13在中央扩展杏仁核（CeA）中高度表达，其在小鼠模型中对社会行为和自主活动的调控作用已被证实，这为理解其在疼痛-情绪相关神经回路中的潜在作用提供了重要线索。在分子层面，Spata13不仅通过Rac激活促进树突棘形成，从而影响神经元突触可塑性，还通过Rac-MyoII信号通路参与三维基质中细胞迁移的调控。这些特性可能直接影响DRG神经元在神经损伤微环境中的再生行为。基于其在调控细胞骨架动力学、神经元形态发生和突触可塑性中的多种功能，我们推测Spata13可能通过以下机制参与NPP的病理过程：通过调控Rac1活性影响伤害性神经元的异常兴奋性；通过介导DRG神经元损伤后的异常轴突再生和异常神经支配；通过参与疼痛相关脑区（如CeA）神经回路的异常重塑。这些发现不仅拓展了我们对GEF家族蛋白在神经系统中作用的理解，还为针对Spata13信号通路的创新镇痛策略提供了重要的理论依据。

Id4是一种转录因子抑制剂，属于Id蛋白家族。它通过抑制基本螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子的活性来调控基因表达，并在神经系统发育和功能维持中发挥广泛的调控作用。研究表明，Id4通过Notch2-Id4信号轴调控神经干细胞的静息状态，可能影响神经损伤后DRG中伤害性神经元的分化和再生。在调控胶质细胞方面，Id4通过NAD-SIRT2-H3K18Ac表观遗传调控轴参与少突胶质细胞的分化，并且通过ERK1/2-Ca2+信号通路介导的Id4表达变化可能影响星形胶质细胞的激活状态。此外，Id4在室管膜细胞发育和纤毛功能中的关键作用表明，它可能通过调控脑脊液微环境间接影响疼痛信号。Xu等研究发现，Id4的表达受到MYSM1介导的组蛋白修饰调控，这种表观遗传调控机制可能在神经损伤后基因表达重编程中发挥重要作用。

本研究发现的五种生物标志物在NPP中显著富集于核糖体、p53信号通路、氧化磷酸化、蛋白酶体和神经活性配体-受体相互作用等关键通路。这些通路的异常可能通过多种机制参与NPP的发生和发展。例如，核糖体通路的异常可能通过影响与疼痛相关的蛋白（如Nalf1）的合成，参与紫杉醇等化疗药物诱导的神经病理性疼痛。p53信号通路在NPP中具有双重作用，一方面参与神经元凋亡的调控，另一方面通过靶向作用如杜克西汀等药物缓解疼痛，并在神经再生过程中发挥重要调控作用。异常的氧化磷酸化通路与线粒体功能障碍密切相关，线粒体衍生肽MOTS-c通过AMPK通路抑制小胶质细胞激活和脊髓中的神经元氧化损伤，从而改善小鼠的神经病理性疼痛。Kasembeli等研究发现，STAT3抑制剂能够防止氧化磷酸化异常并逆转NPP小鼠模型中的机械性痛觉过敏。蛋白酶体系统在NPP中发生显著改变，慢性疼痛易感性与泛素-蛋白酶体系统的功能障碍密切相关。蛋白酶体抑制剂如oprozolomib能够逆转化疗诱导的神经病理性疼痛，表明蛋白质稳态失衡在疼痛发生中的关键作用。此外，神经活性配体-受体相互作用通路通过信号分子如TLR2/MyD88调控小胶质细胞释放炎症因子，参与疼痛信号的传递和调控。这些通路共同构成了复杂的分子网络，通过影响神经元兴奋性、胶质细胞激活、氧化应激反应和蛋白质稳态，参与NPP的发生和发展。

NPP的发生和发展与免疫微环境的动态重塑密切相关，其中M2巨噬细胞和NK细胞的协同调控在其中起着关键作用。研究表明，巨噬细胞在NPP进展过程中表现出显著的功能可塑性。促炎性M1巨噬细胞通过释放炎症因子如TNF-α和IFN-γ加重疼痛，而抗炎性M2巨噬细胞则通过多种机制发挥镇痛作用，如分泌阿片肽激活外周阿片受体、通过TGF-β信号通路抑制炎症反应，以及通过增强内吞作用清除凋亡细胞。M2巨噬细胞极化能够缓解NPP，这在乳酸杆菌植物乳杆菌干预和纳米医学治疗中得到了验证。同时，NK细胞通过分泌TNF-α等因子影响神经元敏感性，并与巨噬细胞等免疫细胞合作调节疼痛信号通路。一项临床研究显示，NK细胞频率与机械性疼痛敏感性之间存在显著的负相关，表明NK细胞可能通过调节神经炎症级联反应抑制中枢敏化。这些发现不仅加深了我们对NPP神经免疫机制的理解，还为基于免疫细胞调控的新型镇痛策略提供了重要的理论基础。

综上所述，本研究基于GEO数据库（GSE102721、GSE96051、GSE174430）的生物信息学分析，成功鉴定了与NPP密切相关且具有重要功能的五种生物标志物：Myo10、Rhoq、Sema6a、Spata13和Id4。这些生物标志物的发现不仅揭示了它们在SGCs中的关键作用，还为构建可靠的疾病风险预测模型提供了依据。通过差异基因分析、细胞通讯分析和网络构建，我们进一步明确了这些生物标志物在NPP中的重要性。此外，MR分析支持了Myo10和Sema6a在药物诱导性神经病变和腰椎间盘突出伴坐骨神经痛中的潜在保护作用。然而，本研究仍存在一些局限性。首先，样本量相对较小，研究主要依赖于公共数据库的二次分析，缺乏独立队列验证。其次，研究结果尚未通过体外或体内实验进行验证。未来，我们计划通过扩大样本量、进行功能实验和建立动物模型，进一步验证这些发现，以提供更可靠的NPP精准诊断和治疗依据。