综述：基于深度学习的新兴污染物筛查技术：创新与技术进步

《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Deep learning-driven screening of emerging contaminants: Innovations and technological advances

集成等温核酸扩增（INAATs）与CRISPR系统的单一步骤检测技术，通过协同作用提升灵敏度和特异性，但存在模板竞争、信号延迟和扩增抑制等挑战，需通过空间隔离、温度优化、CRISPR活性调控及系统设计改进解决。

　　在现代生物医学检测领域，快速、高灵敏度和高特异性的核酸检测技术已成为研究的重点。传统的聚合酶链式反应（PCR）虽然在特异性和灵敏度方面表现优异，但其依赖复杂的温度循环过程，使得操作繁琐、设备昂贵且不便于现场应用。为了解决这些问题，等温核酸扩增技术（INAATs）应运而生，这类技术能够在恒定温度下实现核酸扩增，大大缩短了检测时间，并降低了对专业设备的需求。同时，基于CRISPR的系统因其可编程性和高特异性，成为核酸识别和检测的重要工具。将这两种技术结合，既保留了INAATs的快速和简便，又利用CRISPR的高特异性，实现了更高效、更准确的检测方法。然而，这种集成方法在实际应用中仍然面临一些关键挑战，其中竞争性相互作用尤为突出。

INAATs和CRISPR技术的结合在诊断领域具有广泛的应用前景。INAATs能够在短时间内完成核酸扩增，而CRISPR则能够精准识别目标核酸并产生可检测信号。这种组合不仅提高了检测效率，还减少了操作步骤和实验误差。然而，由于这两种技术在反应条件和分子机制上的差异，它们之间的竞争性相互作用成为影响检测性能的关键因素。这种竞争不仅发生在扩增过程中，还可能在CRISPR识别目标后继续影响信号的稳定性。因此，如何有效解决这两种技术之间的竞争性相互作用，成为当前研究的核心问题。

竞争性相互作用主要体现在两个方面。一方面，在INAATs的早期阶段，原始模板或扩增产物可能过早激活CRISPR系统，导致非特异性切割，从而影响扩增效率和检测灵敏度。另一方面，在CRISPR识别目标后，其转切割活性可能导致单链DNA的非特异性降解，干扰INAATs所需的引物或探针，进一步降低检测的准确性。这些相互作用不仅影响检测结果，还可能引入假阴性或假阳性，限制了其在临床诊断中的应用。因此，科学家们正在探索多种策略，以解决这些竞争性问题，提高检测性能。

为了克服这些挑战，研究人员提出了多种解决方案。首先，空间隔离是一种有效的策略，通过物理分离INAATs和CRISPR反应的区域，减少它们之间的相互干扰。其次，时间差分离可以通过控制反应顺序，使INAATs先完成扩增，再进行CRISPR检测，从而避免提前激活。此外，通过优化CRISPR系统的活性，如使用弱化的Cas蛋白或调整其识别能力，也可以降低竞争性相互作用的影响。最后，系统优化是提高检测性能的关键手段，包括改进反应条件、调整引物设计、优化检测信号等。

在实际应用中，这些策略已经被成功验证。例如，一些新型的核酸检测系统通过空间隔离和时间差分离，实现了更高的检测灵敏度和准确性。同时，通过优化CRISPR系统的活性，如使用耐热的Cas蛋白变体，能够提高其在等温条件下的稳定性。此外，系统优化还涉及改进反应条件，如调整温度、优化缓冲液成分等，以确保INAATs和CRISPR反应的同步进行。这些策略的综合应用，不仅提高了检测性能，还增强了系统的可靠性。

随着技术的发展，基于CRISPR的核酸检测技术已经逐步应用于临床、环境监测和食品安全等多个领域。这些技术的优势在于其高灵敏度、高特异性和简便操作，使得其在实际应用中具有广泛的前景。然而，由于竞争性相互作用的存在，这些技术在某些应用场景中仍然受到限制。因此，科学家们正在积极探索新的解决方案，以进一步提高检测性能和应用范围。

在当前的研究中，一些新型的检测平台通过集成INAATs和CRISPR技术，实现了更高的检测灵敏度和准确性。例如，HOLMESv2系统通过使用耐热的Cas12b蛋白，结合LAMP扩增技术，实现了对目标核酸的快速和定量检测。同时，CRISPR-TOP和iSCAN-OP等系统也成功实现了单管检测，提高了检测的便捷性和可靠性。这些系统的成功应用，表明集成INAATs和CRISPR技术具有广阔的前景。

尽管如此，这些集成平台仍然面临一些技术挑战。其中，温度兼容性是一个关键问题。不同类型的INAATs使用不同的聚合酶，每种聚合酶都有其最适反应温度。而CRISPR系统通常在37°C左右工作，其最佳反应温度范围为20-48°C。因此，某些INAATs可能无法与CRISPR系统兼容，导致反应效率下降。例如，LAMP的最适反应温度为65°C，这接近许多Cas蛋白的失活温度（如65°C持续10分钟）。因此，需要在温度兼容性方面进行优化，以确保两种技术的协同作用。

为了解决温度兼容性问题，科学家们提出了多种策略。例如，通过优化反应温度，使INAATs和CRISPR系统能够在同一温度下运行。此外，通过发现耐热的Cas蛋白变体，如YmeCas12a、Cas12b、TccCas13a和HheCas13a等，能够提高其在高温条件下的稳定性。这些变体的发现，为解决温度兼容性问题提供了新的思路。此外，一些系统通过分阶段温度控制，使INAATs和CRISPR反应能够在不同的温度下进行，从而减少相互干扰。

除了温度兼容性，竞争性相互作用仍然是影响检测性能的关键因素。为了有效解决这一问题，科学家们正在探索新的方法。例如，通过优化引物设计，减少INAATs和CRISPR反应之间的竞争。此外，通过改进反应条件，如调整反应时间、优化反应环境等，能够减少竞争性相互作用的影响。这些方法的综合应用，不仅提高了检测性能，还增强了系统的可靠性。

随着技术的不断进步，基于CRISPR的核酸检测技术正在逐步完善。这些技术的优势在于其高灵敏度、高特异性和简便操作，使得其在实际应用中具有广泛的前景。然而，竞争性相互作用仍然是影响检测性能的关键因素。因此，科学家们正在积极探索新的解决方案，以进一步提高检测性能和应用范围。

在未来的诊断技术发展中，基于CRISPR的核酸检测技术有望成为主流。通过解决温度兼容性和竞争性相互作用等问题，这些技术将能够更广泛地应用于临床、环境监测和食品安全等多个领域。此外，随着检测设备的不断优化，这些技术的便携性和可操作性也将得到进一步提升。因此，基于CRISPR的核酸检测技术具有广阔的前景，将在未来的诊断技术发展中发挥重要作用。

总之，基于CRISPR的核酸检测技术在现代生物医学检测领域具有重要的应用价值。通过结合INAATs和CRISPR技术，可以实现更高的检测灵敏度和准确性。然而，温度兼容性和竞争性相互作用仍然是影响检测性能的关键因素。因此，科学家们正在积极探索新的解决方案，以进一步提高检测性能和应用范围。这些技术的发展，不仅有助于提高诊断的准确性，还将推动诊断试剂的创新和应用，为未来的医学发展提供有力支持。