机器学习揭示FLNA作为脊髓损伤后调控神经元凋亡的关键分子靶点

《Journal of Molecular Neuroscience》：Machine Learning Identifies FLNA as a Key Molecular Target Regulating Neuronal Apoptosis after Spinal Cord Injury

本研究针对脊髓损伤(SCI)后神经元凋亡机制不明的难题，通过整合多组学数据和机器学习算法，发现Filamin A(FLNA)是调控神经元凋亡的关键靶点。实验验证表明FLNA通过PI3K/AKT通路影响线粒体功能，其沉默可减轻H2O2诱导的PC12细胞凋亡和ROS产生。该研究为SCI治疗提供了新的分子靶点和理论依据。

　　

当脊髓受到严重损伤时，神经元会像多米诺骨牌一样接连死亡，这种被称为"二次损伤"的病理过程是导致神经功能障碍的主要原因。尽管科学家们已经知道细胞凋亡在这一过程中扮演重要角色，但究竟哪些分子在背后操控着神经元的生死命运，仍然是个未解之谜。脊髓损伤(SCI)作为一种严重的中枢神经系统创伤性疾病，往往导致损伤平面以下的感觉和运动功能永久性丧失，给患者家庭和社会带来沉重负担。在损伤后的复杂病理级联反应中，过量产生的活性氧(ROS)会引发氧化应激，进而导致线粒体功能障碍和神经元凋亡，严重阻碍神经功能恢复。

发表在《Journal of Molecular Neuroscience》上的这项研究，通过整合多组学分析和机器学习算法，成功揭示了Filamin A(FLNA)这一细胞骨架相关蛋白在脊髓损伤后神经元凋亡过程中的关键调控作用。研究人员发现FLNA可能通过影响PI3K/AKT信号通路和线粒体功能，成为干预神经元凋亡的潜在靶点。

为了开展这项研究，团队采用了多种关键技术方法：首先通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对脊髓损伤大鼠模型五个时间点(1、3、7、14、28天)的脊髓组织进行蛋白质组学分析；利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)和机器学习算法(随机森林和LASSO回归)筛选关键蛋白；通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析FLNA在不同细胞类型中的表达分布；最后在大鼠模型和PC12细胞系中通过Western blot、qRT-PCR、CCK-8法和DHE荧光染色等技术进行实验验证。

差异表达蛋白的时序特征

研究人员通过主成分分析证实了实验分组的合理性，在不同时间点共鉴定出351个差异表达蛋白(DEPs)，其中92个上调，259个下调。这些蛋白的表达模式呈现出明显的时间动态特征：早期(1-7天)主要涉及炎症反应和线粒体功能相关蛋白，而后期(14-28天)则更多与突触功能相关。

关键模块蛋白的识别

通过WGCNA分析，研究人员构建了蛋白质共表达网络，发现绿色模块与脊髓损伤的相关性最强(r=0.7, P=0.00002)。该模块中的基因表现出高度协同的表达模式，提示它们可能共同参与特定的生物学过程。

功能富集分析揭示生物学通路

将351个差异表达蛋白与WGCNA关键模块取交集后，获得42个核心蛋白。GO富集分析显示这些蛋白主要参与急性炎症反应、内肽酶活性负调控等生物学过程，而KEGG分析则发现它们富集于补体凝血级联、铁死亡等信号通路。

机器学习筛选关键靶点

研究人员运用两种机器学习算法对42个核心蛋白进行筛选。LASSO回归确定了5个特征蛋白，随机森林算法则识别出8个重要蛋白。令人惊讶的是，两种方法的交集只有一个蛋白——FLNA。

FLNA的诊断价值验证

ROC曲线分析显示，FLNA在训练集和两个验证集(GSE183591和GSE45006)中的AUC(曲线下面积)均达到100%，表现出卓越的诊断区分能力。Western blot和qRT-PCR结果证实，脊髓损伤后FLNA的蛋白和mRNA表达水平均显著上调。

单细胞水平表达特征

单细胞测序分析揭示了FLNA在不同细胞类型中的表达异质性。FLNA在内皮细胞和神经元中表达最高，这种细胞类型特异性提示其可能在不同细胞中发挥不同的生物学功能。

FLNA相关功能网络

通过分析FLNA表达最相关的100个蛋白，研究人员发现这些蛋白主要富集于线粒体氧化磷酸化、神经退行性变和细胞凋亡等通路，提示FLNA可能通过调节线粒体功能影响神经元存活。

功能验证实验

在细胞实验中，研究人员发现30μmol/L的H₂O₂是PC12细胞的半致死浓度。通过siRNA沉默FLNA表达后，H₂O₂诱导的细胞凋亡显著减轻，细胞内ROS水平明显下降。机制研究表明，FLNA沉默可激活PI3K/AKT信号通路，这可能是其保护作用的重要机制。

这项研究的结论部分强调，FLNA作为细胞骨架相关蛋白，在脊髓损伤后神经元凋亡过程中发挥关键作用。通过整合蛋白质组学、机器学习和实验验证，研究不仅发现了FLNA这一潜在生物标志物，还揭示了其可能通过PI3K/AKT通路影响线粒体功能和氧化应激的分子机制。

讨论部分进一步阐述了FLNA在神经系统中的多重功能。作为重要的细胞骨架调节蛋白，FLNA不仅参与维持神经元形态结构，还在细胞信号转导中起桥梁作用。研究表明FLNA在内皮细胞和神经元中的高表达特性，与其在血脑屏障功能和树突发育中的已知作用相吻合。特别值得注意的是，FLNA表达沉默后对PI3K/AKT通路的激活效应，为理解细胞骨架蛋白与生存信号通路之间的交叉对话提供了新视角。

该研究的创新之处在于首次系统地将FLNA与脊髓损伤后神经元凋亡联系起来，并通过多层次证据链验证其功能重要性。从临床转化角度，FLNA在多个数据集中的完美诊断区分能力(AUC=100%)表明其具有显著的生物标志物潜力。同时，针对FLNA的干预策略可能为脊髓损伤治疗提供新思路，特别是通过调节PI3K/AKT信号通路来改善线粒体功能、减轻氧化应激损伤。

然而，研究也存在一些局限性，如FLNA与PI3K/AKT通路相互作用的具体分子机制尚未完全阐明，需要在未来研究中进一步探索。此外，虽然PC12细胞模型为体外机制研究提供了便利，但其与体内神经元的差异仍需谨慎对待。

总体而言，这项由裴英凡、胡耀瑞、冯国英等共同第一作者，张璐平教授和黄飞教授共同通讯完成的研究，不仅为脊髓损伤的分子机制提供了新见解，也展示了多组学数据与机器学习算法相结合在生物标志物发现中的强大应用价值。该研究成果为开发针对脊髓损伤的新型诊断和治疗策略奠定了重要基础。