原位扩增揭示帕金森病和路易体痴呆相关α-突触核蛋白淀粉样纤维新 polymorph

《Cell Reports》：In situ amplification of α-synuclein amyloid fibril reveals a distinct polymorph related to Parkinson’s disease and dementia with Lewy body

本刊推荐：为解决传统淀粉样纤维提取方法可能造成的结构偏好性问题，Cao等人开展α-突触核蛋白(α-syn)原位扩增(ISA)研究。通过直接在PD/DLB脑组织匀浆中扩增α-syn纤维，结合冷冻电镜(cryo-EM)技术，发现了一种不同于Lewy fold的新型polymorph ISA-P1，该结构与MSA和JOS来源纤维相似，提示不同突触核蛋白病间存在共同的结构基序，为理解疾病异质性提供了新视角。

　　

在神经退行性疾病研究领域，α-突触核蛋白(α-syn)的异常聚集一直是科学家们关注的焦点。这种蛋白质在帕金森病(Parkinson's disease, PD)和路易体痴呆(dementia with Lewy bodies, DLB)患者的大脑中以淀粉样纤维的形式存在，形成特征性的路易体和路易神经突。然而，这些纤维结构并非单一不变，而是表现出丰富的多态性(polymorphism)，这种结构多样性被认为与疾病不同的临床表现和病理特征密切相关。

传统上，研究人员通过从脑组织中提取纯化α-syn纤维来研究其高分辨率结构。这种方法虽然取得了重要突破，如最近鉴定的"Lewy fold"结构，但存在明显局限性。提取过程基于淀粉样纤维的物理化学特性，涉及盐浓度变化和超速离心等步骤，可能导致某些结构类型的优先分离或大量纤维丢失，从而引入研究偏差。这就引出了一个关键问题：我们通过传统方法看到的纤维结构是否真实反映了疾病状态下的大脑实际情况？

为了回答这一问题，上海交通大学李丹团队开发了一种创新策略——原位扩增(in situ amplification, ISA)技术。这种方法不将纤维从脑组织中提取出来，而是直接在疾病脑组织匀浆中扩增α-syn纤维，最大限度地保留了疾病特异性的分子环境。

研究人员选取了三位捐赠者的脑组织进行研究：一位86岁女性PD患者（捐赠者1）、一位75岁女性DLB患者（捐赠者2）和一位85岁无神经退行性疾病症状的健康对照（捐赠者3）。根据α-syn病理的不同传播模式（PD通常始于脑干，而DLB始于新皮层），他们分别从PD患者的延髓和DLB患者的额皮层取样。

通过免疫组织化学染色，研究团队确认了两位患者脑组织中存在磷酸化S129 α-syn阳性的路易体和路易神经突，而健康对照中未见α-syn聚集物。随后，他们将脑组织匀浆（浓度0.2 g/mL）与50μM α-syn单体混合，在37°C、900 rpm条件下震荡培养5天，进行ISA反应。

负染透射电子显微镜(NS-TEM)结果显示，PD和DLB脑匀浆中均扩增出了丰富的淀粉样纤维（分别称为ISA_PD和ISA_DLB纤维），而健康对照中未见纤维形成。这表明ISA纤维确实源于患者大脑的疾病环境，而非非特异性聚集。

为了深入解析这些纤维的结构特征，研究团队使用300-kV Titan Krios显微镜收集了冷冻电镜(cryo-EM)数据。通过二维分类分析，他们发现ISA纤维实际上是由多种结构多态性组成的混合物。令人惊讶的是，在PD和DLB来源的ISA纤维中，存在三种共同的多态性（P1-P3），其中ISA-P1是主要物种，分别占PD和DLB来源ISA纤维的61.9%和50.1%。

ISA-P2（占PD的20.9%，DLB的6.3%）形态与先前报道的Lewy fold相似，但扭曲程度较轻，宽度为6.3-6.6 nm。ISA-P3（占PD的5.6%，DLB的5.1%）则表现为宽的双链丝状结构。此外，DLB来源的ISA纤维显示出比PD更多的多态性，且至少有一种独特的多态性仅存在于DLB而非PD样本中。

研究团队成功解析了主要物种ISA-P1的高分辨率结构（ISA_PD-P1分辨率为3.1 ?，ISA_DLB-P1为3.3 ?）。结果显示，来自PD和DLB的ISA-P1纤维几乎完全相同（87个Cα原子的RMSD为0.265 ?），均由左手性单原纤维组成，核心区域跨越G14-L100残基。

最为引人注目的是，ISA-P1纤维核心由八个β链(β1-β8)形成蛇形结构，这与Lewy fold及其他已知α-syn纤维结构截然不同。更值得注意的是，研究人员在纤维核心的三个特定位点（位点1-3）观察到了与纤维轴平行的管状密度，这些很可能是在纤维组装过程中掺入的疾病相关共因子(cofactors)。

位点1位于K23-G25和V55-E57残基之间，可能容纳长度为9.6-14.4 ?的共因子，该位点可能通过静电相互作用和相邻的K23-E57盐桥稳定纤维核心的外层β1-β2。位点2位于β3-β4和β5-β6的转角之间，该处的共因子更具疏水性，长度约为24.0 ?。位点3位于β2-β3转角处，介于两个疏水残基L38和V40之间，可能结合长度为19.2 ?的共因子，与T54、A56、T72、G73和V74等残基相互作用。

通过比较结构分析，研究人员发现ISA-P1与多种来源的α-syn纤维多态性共享一个共同的原型结构基序(prototypic structural motif)，这些多态性可根据制备方法分为四组：脑ISA纤维（ISA-P1）、体外重构纤维（野生型和家族性PD突变体）、脑来源或脑脊液来源纤维种子体外扩增产物、以及从MSA和JOS患者脑中分离的纤维。

特别值得注意的是，ISA和ex vivo纤维（第1和第4组）比体外制备的纤维（第2和第3组）具有更大的纤维核心，涉及更长的N端区域，这很可能是在病理环境中共因子掺入的结果。ISA-P1的原型核心与ex vivo MSA和JOS多态性的相似性高于体外制备的多态性，尤其是与ex vivo JOS多态性整体相似性最高（覆盖54个Cα原子的RMSD为0.65 ?）。

主要技术方法概述

本研究关键技术包括：采用患者脑组织样本（PD延髓、DLB额皮层、健康对照）进行免疫组织化学染色验证α-syn病理；建立α-syn原位扩增(ISA)方法，直接在脑匀浆中扩增纤维；运用冷冻电镜(cryo-EM)技术进行结构解析，包括二维分类、三维螺旋重构和高分辨率结构测定；通过比较结构分析将ISA-P1与已知α-syn纤维结构进行比对。

神经病理学表征证实脑组织中存在α-syn病理

通过对三位捐赠者脑组织的免疫组织化学分析，研究人员确认了PD患者延髓和DLB患者额皮层中存在磷酸化S129 α-syn阳性的路易体和路易神经突，而健康对照脑中未见α-syn聚集物，为后续ISA实验提供了病理学基础。

ISA在脑匀浆中成功扩增出α-syn纤维

将α-syn单体与PD、DLB和健康对照的脑匀浆共同培养后，NS-TEM显示仅在疾病脑匀浆中形成了丰富的淀粉样纤维，且PD和DLB来源的ISA纤维形态相似，证明ISA方法能够在疾病特异性环境中有效扩增α-syn纤维。

冷冻电镜二维分类显示ISA纤维包含多种多态性

通过对ISA纤维颗粒的二维分类分析，发现PD和DLB来源的ISA纤维均是由多种结构多态性组成的混合物，其中三种共同多态性(P1-P3)在两种疾病中均有存在，但比例和次要多态性存在差异，揭示了α-syn纤维在疾病大脑中的结构多样性。

ISA-P1纤维的冷冻电镜结构揭示独特多态性

高分辨率结构解析显示ISA-P1是一种不同于Lewy fold的新型结构，由八个β链形成蛇形折叠，并在三个特定位点结合了可能源于疾病环境的共因子，提示分子环境对纤维结构形成的重要影响。

不同α-syn纤维多态性共享共同原型结构基序

比较结构分析发现ISA-P1与多种来源的α-syn纤维共享一个共同的结构核心，且与从MSA和JOS患者脑中直接分离的纤维结构更为相似，表明不同突触核蛋白病之间可能存在共同的结构形成机制。

这项研究通过ISA技术成功避免了传统纤维提取方法可能带来的结构偏好性，首次揭示了PD和DLB患者脑中存在与MSA和JOS相似的新型α-syn纤维结构ISA-P1。这一发现不仅拓展了我们对α-syn结构多态性的认识，更重要的是提出了不同突触核蛋白病可能共享共同结构基序的新观点。

研究的创新之处在于将扩增过程置于疾病本身的分子环境中进行，从而保留了可能影响纤维结构的疾病特异性因子。在ISA-P1纤维中观察到的共因子结合位点，为理解疾病相关分子如何调控α-syn纤维形成提供了直接证据。

这些发现对理解突触核蛋白病的发病机制具有重要意义：首先，ISA-P1在不同个体和脑区的保守性表明这种结构可能在某些病理条件下特别有利；其次，不同疾病共享相似结构提示可能存在共同的毒性机制；最后，ISA方法为研究其他蛋白聚集性疾病提供了新思路。

当然，研究也存在一定局限性，如ISA过程的动力学特性可能影响不同多态性的相对比例，使得观察到的多态性分布不能完全代表其在原生脑组织中的真实情况。此外，不同疾病案例中观察到的多态性差异可能源于多种生物变量（如疾病病理、解剖起源和个体差异），难以将结构差异单纯归因于疾病特异性因素。

总体而言，这项发表于《Cell Reports》的研究通过创新性的实验方法，揭示了α-syn纤维在神经退行性疾病中的结构多样性，为理解不同突触核蛋白病之间的关联提供了新的结构生物学视角，对未来开发针对特定α-syn纤维结构的诊断和治疗策略具有重要指导意义。