后部增强子（p-Enh）在胃胚形成期维持早期神经中胚层祖细胞双能性的机制研究

《Cell Regeneration》：Posterior enhancer (p-Enh) maintains early neuromesodermal progenitors bi-potency during gastrulation

本研究聚焦于脊椎动物后轴发育关键时期——胃胚形成期，揭示了后部增强子（p-Enh）在维持神经中胚层祖细胞（NMPs）双能性中的核心作用。研究人员通过高效的体外分化系统、时间分辨转录组分析和新型生物信息学工具ST-Pheno，发现p-Enh缺失会导致NMPs亚型组成紊乱，偏向产生中胚层倾向的ThighSOX2low亚群，进而破坏脊髓（SC）和体节前中胚层（PSM）的正常分化轨迹。该研究为理解哺乳动物胚胎发育中细胞命运决定的表观遗传调控机制提供了重要分子见解。

　　

在脊椎动物胚胎发育的宏伟蓝图中，胃胚形成（Gastrulation）是一个至关重要的阶段，它如同一位技艺精湛的建筑师，通过精确的细胞命运分配，构建出外胚层、中胚层和内胚层这三层基本结构，并初步勾勒出胚胎的身体蓝图。在这一过程中，有一群特殊的细胞——神经中胚层祖细胞（Neuromesodermal Progenitors, NMPs），它们拥有生成后部脊髓（Spinal Cord, SC）和体节前中胚层（Presomitic Mesoderm, PSM）的双重潜能，是驱动胚胎后体轴延伸的关键力量。然而，NMPs的这种双能性是如何在发育早期被建立和维持的，其背后的分子调控机制仍有许多未解之谜。

先前的研究发现了一个在胃胚期就被预先标记的后部增强子（posterior enhancer, p-Enh），它在E7.5阶段（胚胎发育第7.5天）的后部外胚层细胞中表现出染色质可及性和H3K27ac修饰，并且对于器官发生期胚胎的后部组织发育至关重要。然而，这个增强子在早期NMPs细胞身份调控中的具体作用仍然模糊不清。为了解开这个谜题，研究人员开展了一项系统的研究，成果发表在《Cell Regeneration》上。

为了深入探究p-Enh在NMPs命运决定中的功能，研究人员综合运用了体外、体内和计算模拟的方法。他们首先建立了一个高效的小鼠胚胎干细胞（mESCs）体外定向分化系统，能够逐步模拟从多能干细胞到NMPs，再到SC和PSM祖细胞的发育轨迹。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，他们构建了p-Enh敲除（p-Enh-KO）的细胞系。通过对分化过程中不同时间点的细胞进行免疫荧光染色、定量PCR（qPCR）以及时间分辨的批量RNA测序（RNA-seq）分析，详细评估了p-Enh缺失对细胞状态和基因表达的影响。此外，他们还开发了一个名为ST-Pheno的新型生物信息学工具，能够将体外样品的转录组数据映射到体内胚胎的空间转录组坐标上，从而在时空背景下解读体外模型的生物学意义。最后，通过对E7.5阶段的野生型（WT）和p-Enh-KO胚胎进行免疫荧光分析，对计算预测的结果进行了实验验证。表观遗传学分析则通过H3K27ac的染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）来探究潜在的调控机制。

In vitro differentiation system recapitulates the developmental trajectory from pluripotent stem cell, NMPs, to prospective PSM and SC

研究人员建立了一个为期五天的阶梯式体外分化系统。免疫荧光和qPCR分析证实，该系统能够成功地使mESCs退出多能性，分化为共表达SOX2和T的NMPs，并最终分化为表达HOXB9和SOX1的SC祖细胞或表达TBX6和MEOX1的PSM祖细胞。该系统高度模拟了体内发育的分子特征，为研究NMPs生物学提供了可靠模型。

p-Enh-KO activates mesoderm-related gene signatures during in vitro differentiation and boosts the enrichment of mesoderm-primed NMPs subtype

研究发现，p-Enh的缺失并不影响mESCs的多能性，但会导致分化至D3天时NMPs的标志基因表达严重紊乱：T基因表达显著上调，而Sox2表达下调。在单细胞水平上，p-Enh-KO导致NMPs群体中中胚层倾向的T^highSOX2^low亚群比例显著增加，而神经倾向的T^lowSOX2^high亚群比例减少。H3K27ac ChIP-seq分析显示，p-Enh-KO的NMPs中，T基因启动子等中胚层相关基因位点的组蛋白乙酰化水平升高，提示表观遗传景观的改变。这种早期偏向性导致在后续向PSM分化时，中胚层标记物（如Tbx6, Mesp1）异常高表达；而在向SC分化时，神经标记物（如Hoxb9）表达受损。

p-Enh deletion leads to pre-activation of mesoderm related TF regulons at D3 NMPs

时间分辨转录组分析进一步证实，p-Enh的缺失从D3 NMPs阶段就开始扰乱正常的转录组轨迹。差异表达基因（DEGs）分析和基因本体（GO）富集分析均显示，中胚层相关基因签名在p-Enh-KO组中被持续激活，即使在SC分化条件下也是如此。通过SCENIC进行的转录因子调控子（regulon）分析发现，p-Enh-KO增强了中胚层促进性转录因子（如T, Tbx6, Meox1等）调控子的活性，而这些调控子所富集的生物学过程与体节发生和轴模式形成相关。

ST-Pheno captures the spatiotemporal origin for p-Enh-KO induced T^highSox2^low NMPs subtype

为了将体外发现与体内胚胎发育联系起来，研究人员开发了ST-Pheno框架。该分析预测，与WT对照相比，p-Enh-KO的D3 NMPs在空间上更倾向于定位到E7.5胚胎的前原条（Anterior Primitive Streak, APS）及邻近中胚层区域。这种空间偏好性在后续的分化阶段中进一步加强。对E7.5胚胎的免疫荧光分析验证了这一预测，在p-Enh-KO胚胎的APS和邻近中胚层区域确实观察到了T^highSOX2^low细胞的异常积累。

这项研究系统地揭示了后部增强子p-Enh在胃胚形成期维持NMPs双能性的关键作用。其核心结论在于，p-Enh作为一个重要的表观遗传调控元件，通过维持NMPs内部T-SOX2平衡的核心电路，防止细胞过早地向中胚层命运偏移。p-Enh的缺失会破坏这种平衡，导致中胚层倾向的NMPs亚群扩增，表观遗传景观改变（如T基因位点H3K27ac增加），并持续激活中胚层相关的转录程序，最终损害了脊髓发育的潜能，造成后部体轴发育异常。

研究的深刻意义在于，它将一个特定的增强子功能与胚胎发育早期祖细胞命运决定的精确时序控制联系起来，强调了增强子“预标记”（pre-marking）对于发育稳健性的重要性。这不仅拓宽了我们对哺乳动物胚胎发生分子机制的理解，特别是细胞命运决定中的表观遗传调控层面，而且为研究先天性后部体轴畸形等发育性疾病提供了潜在的分子视角和候选靶点。此外，研究所开发的ST-Pheno计算框架，为评估体外模型与体内发育过程的相关性提供了有力的新工具，有助于未来更精准地解析发育和疾病中的细胞扰动效应。