研究小鼠缺血性中风后存活神经元中的细胞变化特征

《Neurochemistry International》：Characterizing stroke-related cellular changes in the surviving neurons of mouse ischemic stroke

快速恢复脑血流对减轻中风神经元损伤至关重要。本研究通过单核苷酸测序（snRNA-seq）和单细胞测序（scRNA-seq）分析小鼠dMCAO模型急性期和亚急性期细胞动态变化，发现神经元数量在3天显著减少，而内皮细胞增多，14天后出现纤维母细胞样细胞增加。微胶质细胞在3天出现Siglech、P2ry12表达，14天转为DAM表型。snRNA-seq有效捕捉神经元状态变化，揭示Syngap1、Ikbkb、Rock1在神经元死亡中的关键作用，以及CREB-CRTC1通路通过激活自噬（LC3B-II/Atg7上调）促进神经元存活。免疫组化和体内外实验验证了 ROCK抑制剂Fasudil及Metformin通过自噬增强神经保护效果，并发现SynGAP1与PSD-95解离导致ERK1/2过度激活。本研究为中风靶向治疗提供了新机制：调控SynGAP1-PSD-95相互作用、自噬及cAMP通路可能改善缺血半暗带神经元命运。

　　脑卒中是一种全球范围内导致死亡和长期残疾的主要疾病之一。在急性期，快速恢复脑血流对于减少神经元损伤至关重要。本研究利用单核RNA测序（snRNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，对小鼠脑缺血模型中缺血性卒中（IS）急性期和亚急性期的细胞和分子变化进行了系统分析。研究通过分析缺血区域的细胞类型及其基因表达模式，揭示了脑缺血后神经元和胶质细胞的动态变化，并进一步探讨了这些变化在神经保护中的潜在作用。

研究采用C57BL/6小鼠模型，将小鼠分为对照组、假手术组、缺血3天后组和缺血14天后组。snRNA-seq技术能够高效地恢复和分析神经元，显示出在缺血后第3天，谷氨酸能神经元数量下降，而内皮细胞数量上升。基因本体分析（GO）结果显示，神经元死亡、自噬和cAMP生物合成途径在这些变化中发挥了重要作用。研究还发现，Syngap1、Ikbkb和Rock1的表达水平在谷氨酸能神经元亚群中显著升高，这可能表明这些基因在缺血损伤相关的细胞死亡机制中具有重要作用。

此外，研究还探讨了缺血预处理对这些变化的影响。缺血预处理能够抑制Syngap1与PSD-95的分离，从而防止ERK1/2的过度激活。免疫组化分析确认了Syngap1和cAMP反应元件结合蛋白（CREB）信号通路在缺血后3天和14天的激活情况，这与测序结果一致。通过抑制CREB的表达，研究发现其显著降低了神经元的存活率，这进一步说明了CREB在自噬和神经保护中的关键作用。

研究还发现，在缺血后的不同时间点，自噬相关蛋白如LC3B-II/LC3B-I、beclin-1、Atg7和TFEB的表达水平显著上升。使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）可以逆转这些自噬相关蛋白的表达，表明自噬在神经保护中起着重要作用。此外，研究发现，使用雷帕霉素（rapamycin）和二甲双胍（metformin）的联合治疗能够显著降低缺血性神经元死亡，这可能与它们对自噬的促进作用有关。

研究还探讨了CREB信号通路在神经元存活中的作用。在缺血后的3天、7天和14天，CREB的磷酸化水平显著上升，这表明CREB在急性期到亚急性期的神经元存活中持续发挥作用。同时，研究发现，CREB依赖的基因如PGC-1α、BDNF和VEGF-A在缺血后的表达水平显著上升，这些基因的表达可能有助于神经元的存活和功能恢复。此外，CRTC1的核转位在缺血后的7天和14天被观察到，这可能表明CREB-CRTC1信号通路在神经修复中具有重要作用。

在方法学上，研究采用了多种技术手段，包括动物模型的建立、行为测试、脑梗死体积测量、脑血流监测以及免疫组化和Western blot等分子生物学技术。研究还利用了AAV病毒载体来实现特定基因的表达调控，通过不同的实验设计验证了基因表达与神经元存活之间的关系。例如，通过过表达A-CREB，研究发现其显著降低了神经元的存活率，而通过过表达Atg7，研究发现其能够促进自噬并有助于神经元的存活。

尽管研究提供了重要的分子和细胞层面的见解，但同时也指出了研究的局限性。首先，所观察到的现象可能特指dMCAO模型中的梗死区，因此在解释这些结果时需要谨慎。其次，研究仅使用了雄性小鼠，这可能限制了结果在雌性个体中的适用性。此外，由于单核RNA测序无法捕获细胞质中的RNA，因此其在某些转录本的定量方面可能不如单细胞测序全面。这些限制提示未来的研究需要进一步探索不同模型和不同性别个体的反应差异。

总的来说，本研究通过整合单核和单细胞RNA测序技术，揭示了缺血性卒中后神经元和胶质细胞的分子和细胞变化，特别是Syngap1、Ikbkb和Rock1在细胞死亡机制中的作用，以及CREB和自噬在神经保护中的重要性。研究结果不仅加深了我们对卒中后神经元变化的理解，还为开发新的神经保护策略提供了潜在的分子靶点。未来的研究可以进一步探索这些分子机制在人类卒中中的适用性，并开发更有效的治疗方案以改善卒中患者的预后。