基于规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白（Cas12a）的环介导等温扩增（LAMP）技术，可实现商业食品中蚕的便携式可视化检测

《Journal of Food Composition and Analysis》：Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein (Cas12a) integrated loop-mediated isothermal amplification (LAMP) approach for portable and visual detection of silkworm in commercial food products

快速特异性检测蚕蛹的CRISPR/Cas12a整合LAMP方法及其在食品掺假中的应用 CRISPR/Cas12a整合LAMP方法在1小时内实现蚕蛹基因组DNA检测限0.1pg，30分钟内检测掺杂样本至0.01%浓度，特异性区分多种昆虫和非昆虫物种，已在45种加工昆虫食品中验证。方法结合LAMP的快速性和CRISPR的特异性，适用于便携设备现场检测，解决食品掺假和过敏源问题。

　　

金秀敏|苏成满|金海英

韩国庆熙大学食品科学与生物技术系，龙仁17104

摘要

随着对可食用昆虫作为可持续蛋白质来源的需求增加，迫切需要可靠且快速的检测方法来避免食物过敏问题以及防止错误标签或掺假。本研究旨在开发一种结合CRISPR/Cas12a和环介导等温扩增（LAMP）技术的检测方法，该方法通过使用原间隔序列（PAM）位点来最小化假阳性结果，能够在1小时内灵敏且特异性地检测出蚕。所开发的检测方法在多种昆虫和非昆虫物种中表现出良好的特异性，并在30分钟内实现了蚕基因组DNA的检测限为0.1 pg以及添加样本中蚕成分的检测限为0.01%（重量/重量）。此外，该方法在检测45种加工过的可食用昆虫产品中的蚕成分时也表现出稳健的性能。凭借其快速的检测时间、简单性以及与便携式设备的兼容性，CRISPR/Cas12a集成LAMP检测方法为食品认证和过敏原食品的识别提供了可靠且准确的结果，成为传统分子检测方法的有力替代方案。

引言

在各种可食用昆虫中，蚕（Bombyx mori）不仅因其含有缬氨酸和甲硫氨酸等必需氨基酸而被视为潜在的替代食品来源，还被用作治疗糖尿病和腹痛等疾病的健康补充品（Kim等人，2018年；Mahanta等人，2023年）。特别是在东亚地区，蚕传统上因其具有商业价值的蛹和丝而被养殖（Suh等人，2024年）。有趣的是，最近的研究表明蚕具有多种药理功能，如抗氧化、抗癌、抗菌、保护肝脏和抗衰老作用，这推动了蚕作为食品来源的更多应用（Mahanta等人，2023年）。尽管有这些优势，但蚕的外观可能是其消费的一个限制因素。因此，大多数基于蚕的食品产品都以压碎或高度加工的形式销售，以改善其外观。这些高度加工的蚕可能会与各种成分混合，而标签上并未注明，这引发了人们对食品欺诈和掺假的担忧（Kim等人，2018年），这可能会降低行业的利润和声誉，同时影响消费者的安全和信任（Ni等人，2024年）。因此，以压碎或高度加工形式销售的蚕制品必须提供关于其原始昆虫成分的准确信息。

从另一个角度来看，蚕几乎被认为是多种过敏原的来源，包括精氨酸激酶、原肌球蛋白和脂蛋白，这些过敏原已被世界卫生组织/国际免疫学会过敏原命名小组委员会报告（Jeong等人，2015年；Suh等人，2024年；Ribeiro等人，2017年）。在东亚地区，持续有与蚕相关的过敏反应病例报告，大约20%的养蚕业工作者在皮肤测试中呈阳性（Belluco等人，2013年；Ganseman等人，2023年）。因此，可食用昆虫产业需要开发检测食品中蚕成分的方法，以确保信息的准确提供和消费者保护。

传统上，物种鉴定使用基于蛋白质和DNA的方法进行，包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）、衰减全反射傅里叶变换红外光谱、液相色谱-质谱（LC-MS）和聚合酶链反应（PCR）（Francis等人，2020年；Kim等人，2018年；Mellado-Carretero等人，2020年；Ulrich等人，2017年）。例如，Suh等人（2024年）报道了使用蛋白质（LC-MS/MS）和DNA（实时PCR）检测蚕的方法。尽管已有使用实时PCR检测蚕的方法（Kim等人，2018年；Kim等人，2019年；Zarske等人，2021年），但可用于现场应用的检测方法仍然很少。总体而言，基于DNA的方法具有较高的特异性和灵敏度，尤其是在热处理产品中比基于蛋白质的方法更稳定（Dong & Raghavan，2022年）。最近，已经开发了用于现场应用的等温扩增技术，如环介导等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）和重组酶聚合酶扩增（RPA），这些技术对PCR抑制效应具有耐受性（Asadi & Mollasalehi，2021年）。与使用热循环仪的基因分析相比，等温扩增技术的特异性较低（Ozay和McCalla，2021年；Wang等人，2023年）。为了解决这个问题，人们开发了基于CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）和CRISPR相关蛋白（Cas）的核酸检测技术（Wang等人，2023年）。该技术中使用的特定CRISPR RNA（crRNA）可以在存在原间隔序列（PAM）位点的情况下结合双链DNA序列，PAM位点由TTTV（V = G或C或A）组成（Zhang等人，2020年）。PAM位点的存在与否对crRNA的结合具有高度特异性，当crRNA与双链DNA结合时，Cas12a（Cp1f）蛋白会进行切割反应。因此，结合CRISPR/Cas12a的等温扩增技术可以克服特异性不足的问题（Li等人，2018年）。值得注意的是，研究表明LAMP-CRISPR/Cas12a方法在实地应用中能有效识别病原体、病毒、肉类和清真食品（Lee & Oh，2023年；Sen等人，2024年；Wang等人，2023年；Wang等人，2024年；Yu等人，2023年）。

迄今为止，已有许多关于可食用昆虫鉴定的快速且灵敏的检测方法被报道；然而，其中很少有方法同时具备快速、特异性和适合现场应用的特点。据我们所知，目前还没有使用等温扩增检测蚕的方法。因此，本研究旨在通过将LAMP与CRISPR/Cas12a结合，开发出一种具有高特异性的现场应用方法，以减少等温扩增技术中可能出现的假阳性结果。此外，所开发的方法可以通过提供便携式设备（易于在现场使用）和无需特殊设备的诊断方法，有助于方便地检测商业可食用昆虫产品中的掺假情况。

试剂和设备

本研究中使用了多种试剂和材料，包括来自Sigma-Aldrich（美国加州）的琼脂糖粉和无DNase的水。10x NEB Buffer 2.1和Cas12a蛋白购自New England Biolabs（美国伊普斯威奇），重组RNase抑制剂购自TaKaRa Biomedical Technology（中国北京）。2x LAMP master mix购自INSOL（韩国汉南），DNeasy Blood and Tissue试剂盒购自Qiagen（德国希伦）。

高特异性蚕检测方法的开发

为了建立一种快速、特异性强且简单的现场检测蚕的方法，我们选择了结合LAMP等温扩增和CRISPR/Cas12a切割反应（图2）。CRISPR/Cas12a系统由于作用于具有连续PAM位点的特定序列，能够提供高度准确的结果，从而区分阳性结果和假阳性结果（Chaijarasphong等人，2019年）。PAM位点的存在与否是一个限制因素

结论

本研究开发了一种结合便携式设备的CRISPR/Cas12a集成LAMP检测方法，能够以高灵敏度、高效性和实用性检测各种食品中的蚕。通过结合LAMP的等温扩增能力和CRISPR/Cas12a系统的卓越特异性，所开发的检测方法确保了蚕种类的精确识别，同时最小化了假阳性结果的风险。

未引用的参考文献

Masetty等人，（2024年）

CRediT作者贡献声明

苏成满：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学、研究。金秀敏：撰写 – 原稿撰写、可视化、方法学、研究、数据管理。金海英：撰写 – 审稿与编辑、监督、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了韩国食品药品安全部[RS-2024-00333074]的支持。