综述：利用CRISPR-Cas9技术改良乳酸杆菌在青贮饲料生产中的应用：当前认知与未来展望

《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Harnessing CRISPR-Cas9 for Lactobacillus improvement in silage production: current knowledge and future perspectives

本综述系统阐述了CRISPR-Cas9基因编辑技术在青贮饲料用乳酸杆菌（Lactobacillus）定向改良中的前沿进展。文章聚焦青贮发酵面临的发酵效率低、有氧腐败、霉菌毒素污染等核心挑战，提出通过合成生物学手段（如酶基因导入、调控元件优化）构建多功能工程菌株的创新策略。该技术有望突破传统菌株筛选的局限性，为开发兼具高效发酵、益生功能（如产细菌素、γ-氨基丁酸GABA）及环境适应性的下一代青贮接种剂提供革命性工具，推动畜牧业可持续发展。

　　

引言

畜牧业作为全球农业的重要支柱，深刻影响着人类生计。然而，饲料资源短缺、饲料转化效率低以及草原退化等生态问题使畜牧业面临严峻挑战。青贮饲料作为一种通过微生物发酵多种植物材料（如牧草、饲料作物和农业残余物）制成的高品质生物饲料，能够在保持植物材料营养特性的同时实现长期储存，为牲畜在饲料短缺季节提供持续供应，保障稳定的畜牧业生产。

在青贮发酵过程中，乳酸菌（LAB）利用植物生物质中的可溶性糖产生乳酸及其他有益有机酸，降低青贮环境的pH值，从而抑制腐败微生物的生长。研究表明，接种功能性乳酸菌菌株不仅能上调纤维分解酶的表达以提高饲料利用效率，还能促进有益生物活性代谢物的产生，改善动物健康。这些创新显著提升了青贮饲料的营养品质和经济可行性，同时降低了畜牧业对天然草场的依赖，实现了资源节约与生产可持续性的双赢。

在众多微生物中，乳酸杆菌（Lactobacillus）因其极高的乳酸产量、耐酸耐渗透压特性以及益生/后生元属性而被广泛研究和应用。乳酸杆菌产生的酶和代谢物直接影响青贮饲料的发酵品质。然而，天然高性能乳酸杆菌菌株的筛选过程耗时耗力。合成生物学的进步使得在乳酸杆菌中引入功能基因或直接进行基因组编辑成为可能，从而增强其天然特性或赋予新功能。这些工程菌株在青贮饲料中既可作为发酵启动剂，又可作为性能增强剂。

青贮饲料作为畜牧业发展的基石

青贮过程通常经历四个不同阶段：（1）有氧阶段，氧气被植物残留呼吸和微生物活动消耗；（2）发酵阶段，细菌（主要是乳酸菌）在厌氧条件下主导并将水溶性碳水化合物（WSC）转化为有机酸（主要是乳酸），导致pH值迅速下降；（3）稳定阶段，低pH和厌氧条件抑制腐败微生物，保存青贮饲料；（4）取料阶段，暴露于空气会引发有氧腐败风险。因此，接种乳酸菌菌株已成为优化青贮发酵和实现优质饲草保存的关键策略。

青贮饲料被誉为“罐装饲草”，它为牲畜在饲草供应不足的季节提供持续且营养丰富的饲料，在现代畜牧业系统中扮演着至关重要的角色。

多样化底物的高效利用

青贮饲料将丰富的人类不可食用及非常规饲料资源转化为有价值的牲畜饲料，缓解饲料资源短缺的同时也减轻了人畜争粮的压力。传统的青贮原料主要包括饲用谷物（如全株玉米或高粱）和牧草/豆科植物（如苜蓿、燕麦干草或羊草）。面对日益紧张的饲料资源约束，木质纤维素农业残余物如甘蔗渣、菌糠和作物秸秆已被用作替代饲料原料。顽固的植物细胞壁阻碍了动物对营养物质的消化吸收。青贮过程中乳酸菌产生的有机酸和酶部分降解木质素和其他结构性碳水化合物，破坏植物细胞壁结构，从而增强纤维素和半纤维素的可及性，最终提高纤维性植物组分的降解率和消化率。

青贮饲料的消化率高度依赖于青贮添加剂的有效性。对于顽固的非常规饲料原料，可以使用酶制剂和乳酸菌接种剂来提高发酵品质。在青贮过程中通常会补充外源性纤维分解酶。它们与乳酸菌的协同作用已被证明能够降低青贮饲料中的酸性洗涤纤维（ADF）和中性洗涤纤维（NDF）含量，同时增加粗蛋白（CP）和WSC水平。此外，乳酸菌接种剂通过快速酸化和酶-酸协同作用，提高了青贮饲料的营养保存率和纤维降解效率。值得注意的是，产纤维分解酶的乳酸菌接种剂在青贮发酵中起着关键作用。它们兼具发酵和产酶的双重功能，减轻了外源酶补充的经济负担。与直接青贮相比，乳酸菌接种促进了顽固结构性多糖的解体，从而提升了青贮品质。这种方法已成为青贮非常规饲料资源的关键技术。

提升动物生产性能及畜产品质量

青贮饲料对反刍动物的生产性能具有有益影响。过去几十年里，玉米青贮已成为奶牛日粮中主要的牧草成分。将玉米青贮纳入奶牛日粮可提高干物质采食量（DMI）、产奶量和乳蛋白含量。一项综合分析表明，在基于草青贮的日粮中加入51%的玉米青贮显著改善了奶牛的乳成分，蛋白质、脂肪和乳糖产量显著增加。补充青贮使产奶量提高了1.8公斤/天，乳蛋白浓度提高了1.2克/公斤。值得注意的是，随着作物成熟度的提高，干物质含量在300至350克/公斤之间的青贮玉米对奶牛的产奶量和蛋白质含量显示出逐步改善的效果。除了玉米青贮，在饲喂策略中加入接种同型发酵和兼性异型发酵乳酸菌的非玉米牧草青贮，对奶牛的产奶量、乳脂含量和乳蛋白浓度产生积极影响。在单胃动物中，饲喂青贮饲料可塑造猪的肠道微生物群，改善其胴体性状并提高猪肉品质。同样，用经济高效的青贮饲料喂养鸭和鹅对生产指标（在饲料转化率、肉品质和可食用内脏重量方面）产生积极影响，而不影响生长性能或肉的营养成分。总之，基于高质量青贮饲料的动物生产系统增强了农场的可持续性。

促进动物健康

在畜牧业中，饲料不仅应满足动物的营养需求，还应作为有益生物活性化合物的递送载体，以促进健康和生产性能，最终有助于生产高质量的畜产品。青贮过程涉及复杂的动态微生物演替，青贮质量在很大程度上取决于不断变化的微生物群落结构及其代谢输出。研究发现，青贮饲料中富含多种具有抗炎、抗氧化和抗癌活性的功能性代谢物，显示出其在增强牲畜健康性能方面的潜在治疗价值。日粮中添加构树青贮饲料可增强反刍动物的抗氧化状态和免疫能力，这可能归因于其丰富的生物活性化合物，包括酚酸、类黄酮和生物碱。此外，乳酸菌接种剂的应用将进一步优化青贮饲料的有益功能。例如，接种具有高抗氧化活性的植物乳杆菌（L. plantarum）菌株可增强青贮饲料的抗氧化能力，这是由于产生/保存了类胡萝卜素、生育酚和类黄酮等非酶抗氧化剂。饲喂此类青贮饲料有助于减轻动物的氧化损伤，并通过调节乳腺中与抗氧化防御和炎症相关的基因表达来改善其抗氧化状态，最终提高牛奶品质。除了有益化合物，青贮发酵还能有效降低抗生素抗性基因（ARGs）及其病原宿主的丰度。研究表明，植物乳杆菌等接种剂可抑制有害细菌生长，最大限度地减少质粒介导的ARGs转移，从而减少青贮饲料中ARGs（如万古霉素、氨基糖苷类抗性基因）的富集。这种通过饲料-动物-食物链减缓ARGs传播的策略为保障动物健康和食品安全提供了关键途径。

减少霉菌毒素污染

霉菌毒素是由各种真菌产生的有毒次级代谢产物。饲料原料在收获或储存过程中易受真菌（特别是霉菌）污染，随后可能导致霉菌毒素产生。食用含霉菌毒素的饲料会对牲畜产生不利影响，导致器官毒性和损伤、免疫抑制、繁殖力下降、生产力降低甚至死亡。这引发了全球农业生产中重大的饲料安全问题。更严重的是，食物链中的霉菌毒素污染通过二次暴露威胁人类健康。摄入的霉菌毒素及其代谢物可能残留在大多数动物组织和产品（如肉和奶）中。残留的毒素可通过食用这些动物组织和产品传播给人类，构成严重的健康和卫生风险。青贮饲料可降低饲料中的霉菌毒素危害。多种乳酸菌菌株，如植物乳杆菌，被认为可抑制酵母和腐败霉菌的增殖以及霉菌毒素的污染。另一方面，在青贮饲料中添加化学和植物源添加剂可同时抑制酵母和霉菌的繁殖，并破坏霉菌毒素的生物合成途径，为控制青贮饲料的霉菌毒素污染提供了有效策略。

总之，青贮饲料是现代动物农业的基石，提供稳定、高性价比的优质饲料来源。它支持动物健康和生产性能，同时通过减少抗生素使用和缓解环境压力促进可持续实践。尽管存在挑战，但通过持续的技术创新和最佳管理实践，青贮饲料很可能仍然是畜牧生产者不可或缺的饲料资源。

青贮生产与应用面临的挑战

尽管青贮饲料益处显著，但其大规模生产仍面临多重挑战。

发酵效率低

青贮发酵过程中的固有挑战不容忽视，并且往往是下游问题的主要原因。乳酸菌产生乳酸以及随后在青贮生产过程中pH值的快速下降对于抑制病原菌和保存饲料营养价值至关重要。然而，这一过程的建立可能受到多种因素的干扰。首先，青贮发酵依赖于接种剂和附生微生物的联合活动；本地附生细菌的干扰会阻碍发酵的速度和效率。其次，青贮质量受环境温度影响。高温会削弱乳酸菌的生长和代谢，导致异型乳酸发酵，而较低的温度可能降低乳酸菌的生长，导致产酸缓慢。此外，青贮质量还受原料本身特性的影响。例如，一些原料表现出高缓冲能力和低WSC含量（如苜蓿），而另一些则具有高水分特性（如燕麦）。这些因素阻碍了理想发酵模式的快速建立，为梭菌、肠杆菌、酵母和霉菌等不良微生物的增殖提供了时间窗口。这可能导致有害代谢物如氨和丁酸盐的产生，以及二次发酵的发生，最终导致饲料质量差。因此，解决这些发酵瓶颈对于生产支持动物性能和健康的高质量青贮饲料至关重要。

有氧不稳定性

在储存或取料阶段，由于压实不充分、覆盖技术差、取料速度慢或塑料完整性受损，氧气可能渗入青贮饲料，引发好氧微生物（如酵母、霉菌、好氧细菌）的增殖并导致二次发酵。酵母是青贮饲料有氧腐败的主要驱动因素。当其种群数量超过1x10? CFU/克鲜重时，会对有氧稳定性产生不利影响。利用WSC的酵母代谢WSC产生乙醇，而利用乳酸的酵母氧化乳酸释放CO?和热量，导致pH值升高和温度波动。好氧微生物的活动加速了发酵产物的消耗，增加了干物质（DM）损失并降低了青贮饲料的营养价值。此外，不良微生物的增殖可能增加病原体及其代谢物污染的风险，对动物生产性能和健康产生负面影响。因此，抑制好氧微生物活动是确保青贮饲料稳定性的核心挑战。

霉菌毒素污染

饲料原料在收获或储存过程中易受真菌侵染，导致霉菌毒素污染。全球范围内已对青贮饲料中的霉菌毒素进行了大量调查，其中玉米青贮是研究最广泛的。分析的玉米青贮样品普遍显示出严重的霉菌毒素污染，这归因于不理想的青贮条件，大多数样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和伏马菌素的检出率很高。尽管青贮发酵可以通过酸性条件抑制一些真菌生长，但耐酸微生物的代谢活动仍可能导致次级毒素积累。更严重的是，多种霉菌毒素经常以共生形式共存。由于不同黄曲霉毒素和其他代谢物之间的协同效应，毒素组合表现出叠加效应，天然存在的形式可能造成更严重的损害。因此，开发具有抗真菌和解毒双重能力的微生物接种剂是减轻青贮饲料中毒素风险的关键。

饲料降解率低

植物材料具有坚硬的细胞壁，其中纤维素、半纤维素、果胶和木质素等多糖复杂地交织在一起，赋予其显著的物理、化学和微生物抗性。苯丙烷聚合物木质素的存在是细胞壁解构的主要障碍。它不仅形成了顽固的多糖堡垒，还通过阿魏酸和香豆酸与其他多糖的交联产生空间位阻。在青贮过程中，酸以及植物和微生物来源的多糖酶协同降解植物细胞壁，破坏坚固结构并提高植物材料的消化率。然而，大部分木质纤维素仍然保持完整，特别是在高度木质化的材料中，如晚收饲料作物和作物秸秆。这些材料青贮性能差，饲料消化率低，导致资源利用不足。因此，需要更有效的方法来释放细胞壁糖分，提高牲畜对青贮饲料的利用率。

益生功能不足

青贮饲料不仅是营养载体，也是益生元（如寡糖）、益生菌（如乳酸杆菌）和后生元（如细菌素）的递送系统。它通过肠道-器官轴调节动物代谢和免疫力。研究人员已鉴定出能产生生物活性化合物的天然乳酸杆菌菌株，包括细菌素、γ-氨基丁酸（GABA）、胞外多糖（EPS）和吲哚-3-乳酸（ILA）。这些化合物被证明在增强免疫能力、生长性能和整体健康方面具有高效力。

具体而言，细菌素可选择性抑制病原菌（单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌等），维持肠道微生物群平衡，以减少感染和抗生素依赖。作为神经递质，GABA可缓解应激反应，改善采食量和生长性能，同时调节动物的免疫功能。EPS可加强肠道黏液屏障，促进益生菌定植，并调节免疫细胞活性以增强抗病能力。ILA是色氨酸代谢物，可激活芳香烃受体（AhR），减轻肠道炎症，增强上皮屏障完整性，并刺激短链脂肪酸（SCFA）产生以优化能量代谢。然而，关于这些功能性乳酸杆菌菌株在青贮饲料中的应用及其对牲畜影响的研究仍然有限。更多的研究工作应聚焦于分离和增强用于青贮饲料的功能性乳酸杆菌菌株。

提高青贮质量的策略与局限

化学和生物添加剂是改善发酵和优化青贮质量的有效方法。然而，化学添加剂的应用受到限制，而生物添加剂，特别是乳酸菌接种剂，因其能够产生酶或代谢物，提供了一种简单、经济、高效的优质青贮生产方法。

为解决青贮发酵过程中的挑战，越来越多的研究集中于筛选高效乳酸菌菌株以促进发酵快速建立。例如，45°C的高温导致玉米青贮发酵不良，而添加耐热鼠李糖乳杆菌LR753则使乳酸菌种群数量最高，并改善了发酵品质。在低温条件下，Su等人的研究表明，在15°C下青贮60天的燕麦中，接种产胞外多糖的植物乳杆菌L75可获得最低的pH值、最高的乳酸含量和最低的氨态氮浓度。此外，当青贮原料如苜蓿或高水分作物本身青贮潜力较差时，接种乳酸菌菌株可显著提高青贮质量，显著增加乳酸产量，同时降低pH值和纤维含量。

对于控制真菌和霉菌毒素污染，乳酸菌接种剂也是一种有效策略。首先，添加异型发酵乳酸菌，特别是布氏乳杆菌，可在青贮过程中产生大量乙酸，抑制霉菌和酵母菌的生长，提高青贮饲料的有氧稳定性。除了有机酸，还筛选出许多能产生强效抗真菌化合物的乳酸菌菌株。例如，植物乳杆菌MiLAB 14能产生3-(R)-羟基癸酸、3-羟基-5-顺式-十二碳烯酸、3-(R)-羟基十二烷酸和3-(R)-羟基十四烷酸，显著抑制几种霉菌和酵母菌的生长。从青贮饲料中分离的植物乳杆菌MiLAB 393能够合成抗真菌环二肽，包括Cyclo(L-Phe-L-Pro)和Cyclo(L-Phe-trans-4-OH-L-Pro)，以及3-苯基乳酸。此外，某些乳酸菌菌株表现出吸附和生物降解霉菌毒素的能力，从而降低其毒性。

为克服青贮饲料中木质纤维素的顽固性，筛选了能产生纤维分解酶的微生物菌株以增强植物碳水化合物的可利用性。此外，青贮饲料中的益生菌生物活性化合物可增强抗炎和抗氧化能力，从而优化瘤胃微生物功能和动物健康。越来越多产生这些功能代谢物的菌株已被分离出来，显示出开发增值青贮饲料的潜力。除了功能性菌株筛选，复合乳酸菌接种剂已被用于通过互补和协同效应优化发酵谱。

尽管功能性菌株筛选和多菌株互作在青贮改良中已显示效力，但筛选过程仍然耗时耗力。关键挑战包括：（1）天然理想菌株丰度极低，非靶向筛选策略导致获得目标菌株的随机性高；（2）候选菌株常存在功能局限性；（3）乳酸菌群落的性能受底物依赖性影响，阻碍了广谱高效的青贮改良。

工程化乳酸杆菌：青贮改良的合成生物学策略

合成生物学的进步引入了微生物资源开发的新时代，使能够精确设计微生物用于各种生物技术应用。采用设计-构建-测试-学习循环，合成生物学通过迭代优化特定功能和应用，快速开发新的生物系统和工程菌株。这种迭代模型通过计算模拟指导菌株设计，高通量筛选验证性能，并利用实验数据优化预测模型，显著提高了微生物工程效率和成功率。每次迭代都会产生更优的工程菌株，并为未来研究积累宝贵知识。这种工程策略具有深远的适用性，不仅促进新功能基因和生物活性化合物的发现，还创造了具有高生产率、强适应性和增强活性的新型微生物资源。这些优化的微生物在推进农业可持续发展和生产力方面具有巨大潜力。

通过将携带外源基因的重组质粒导入宿主细菌，可以构建具有特定功能的工程菌株。例如，用编码糖苷水解酶的质粒转化乳酸菌，并将其接种到青贮饲料中，可以显著降低纤维含量并改善发酵品质。异源蛋白不仅可以在细胞质中表达，还可以通过共价或非共价附着锚定在微生物表面。通过脂蛋白锚定或细胞壁锚定途径实现的细胞表面展示技术，已成功将功能性β-甘露聚糖酶和壳聚糖酶固定在植物乳杆菌表面，并在寡糖生产中发挥作用。质粒转化提供了一种在乳酸菌中表达异源基因的直接方法，既支持青贮生物质降解，也支持潜在益生元寡糖的生产，这为工程化乳酸杆菌作为全细胞生物催化剂生产具有有益效果的高质量青贮饲料提供了可行性。然而，转化质粒存在基因丢失的风险，并且通常需要抗生素的选择压力。抗生素可能破坏发酵过程中有益微生物群落的平衡，干扰天然的乳酸菌主导的发酵过程。此外，抗生素残留可能通过饲料链进入动物产品和环境，加剧细菌耐药性等公共卫生风险。为确保稳定的基因表达同时消除抗生素选择，通过基因编辑技术将目标基因整合到基因组中是一种可行的解决方案。

乳酸杆菌中的传统基因组编辑技术

依赖于锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶的传统基因组编辑技术开创了基因组编辑时代，实现了在特定基因组位点进行靶向基因删除、插入和突变。这两种系统都由序列特异性DNA结合域与非特异性FokI核酸酶融合而成，形成二聚体，在靶位点产生双链断裂。这会触发细胞基于非同源末端连接或同源定向修复的DNA修复途径，以实现精确的基因组修饰。然而，它们在乳酸杆菌中的实际应用仍然有限。

此外，支持双交换同源重组方法的整合型自杀质粒载体可实现基因组中的插入、删除和替换编辑。使用自杀质粒通过两次同源重组事件将外源DNA片段整合到目标基因位点。在第一次同源重组事件中，整个质粒通过一个同源臂重组整合到基因组中。随后，在另一个同源臂发生第二次同源重组，导致质粒骨架的切除和外源DNA的精确整合。这种两步染色体整合程序已允许研究人员将α-淀粉酶和内切-1,4-β-葡聚糖酶基因稳定地整合到从青贮饲料中分离的植物乳杆菌基因组中，而不留下任何残留的抗性标记或载体序列。这些遗传修饰生物有望提高乳酸杆菌菌株在青贮饲料中的碳水化合物利用效率和酸化效率。然而，双交换同源重组方法繁琐、耗时，通常需要1-2周才能获得阳性克隆。

另一种基因组编辑方法是利用线性核苷酸链作为底物，通过细菌细胞中的同源重组实现基因工程。线性核苷酸链包括双链DNA和单链DNA。重组过程由噬菌体来源的重组酶系统介导，特别是Red/RecET系统。λ噬菌体Red系统由三个关键蛋白组成：Gam、Exo和Bet，而Rac噬菌体RecET系统包含RecE和RecT蛋白。这些组分协同作用以促进高效的遗传修饰。

具体而言，Gam蛋白抑制宿主RecBCD和SbcCD核酸酶，从而保护外源dsDNA免于降解。Exo或RecE的5'→3'外切核酸酶活性处理dsDNA以产生3' ssDNA突出端。ssDNA结合蛋白Bet或RecT包裹生成的ssDNA，防止其被宿主核酸酶降解，同时促进同源重组活性。Yang等人通过生物信息学分析，在植物乳杆菌WCFS1的基因组中鉴定出由lp_0640-0642基因编码的Gam、Bet和Exo类似物。他们随后构建了一个基于dsDNA同源重组的编辑系统，成功在植物乳杆菌WCFS1