SCAD：一种高效递送双链RNA至中枢神经系统及其他组织的模块化平台

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：SCAD: A modular platform for efficient delivery of duplex RNA to the CNS and beyond

本研究针对双链RNA（如siRNA）难以有效递送至肝外组织（特别是中枢神经系统CNS）的挑战，开发了一种名为SCAD（smart chemistry-aided delivery）的模块化递送平台。该平台通过将双链RNA与辅助寡核苷酸（ACO）偶联，增强了其与血浆蛋白的结合能力并促进了细胞摄取。研究人员通过优化ACO的序列、长度、化学修饰（如磷酸硫代PS、2'-MOE）和连接子，筛选出高效SCAD结构。体内实验表明，局部给予SCAD-siRNA可实现CNS广泛分布和持续（超过5个月）的基因沉默，且在肺、关节和眼等肝外组织中也表现良好。SCAD平台具有模块化设计、合成简单、安全性好等优势，为神经退行性疾病等的治疗提供了新工具。

　　

在生物医药领域，寡核苷酸疗法，特别是基于小干扰RNA（siRNA）等双链RNA的治疗策略，为从根源上调控基因表达、治疗遗传性和获得性疾病带来了巨大希望。然而，将这些大分子药物有效地递送到目标组织，尤其是受到血脑屏障（BBB）严密保护的中枢神经系统（CNS），一直是一个巨大的科学难题。虽然N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶联技术已成功实现siRNA药物的肝脏靶向递送，并催生了几款获批的肝靶向药物，但针对阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化（ALS）等CNS相关疾病的RNAi药物研发却步履维艰。传统的递送策略，如脂质纳米粒、抗体-寡核苷酸偶联物（AOC）等，在应用于CNS时，往往面临递送效率低、制造工艺复杂、潜在毒性或无法通过系统性给药有效覆盖深部脑区等诸多挑战。因此，开发一种高效、安全、且能实现CNS广泛分布的递送平台，已成为推动神经领域RNAi疗法进入临床的迫切需求。

在此背景下，由Ractigen Therapeutics和李龙承（Long-Cheng Li）研究员团队领衔的研究，在《Molecular Therapy Nucleic Acids》上发表了一项重要成果，介绍了一种名为“智能化学辅助递送”（SCAD）的新型模块化平台。该研究旨在解决双链RNA向CNS及其他肝外组织有效递送的核心瓶颈。研究人员设想，能否借鉴反义寡核苷酸（ASO）的自递送特性，通过为其“嫁接”一个功能模块，来增强双链RNA的递送能力？SCAD平台的设计灵感正源于此：它将一条不靶向任何基因的单链寡核苷酸——称为辅助寡核苷酸（ACO），通过一个连接子（linker）共价连接到双链RNA（如siRNA）的乘客链（passenger strand）上。这个ACO经过精心设计，含有磷酸硫代（PS）骨架和2'-O-甲氧乙基（2'-MOE）等化学修饰，这些修饰已知能增强寡核苷酸与血浆蛋白（如白蛋白）的结合，从而促进其细胞摄取。

为了验证这一概念并优化平台，研究人员开展了一系列严谨的实验。他们首先证明了SCAD架构的可行性：在新生小鼠侧脑室（i.c.v.）注射Cy3标记的SCAD-siRNA（靶向亨廷顿蛋白基因Htt）后，与未偶联ACO的对照组siRNA相比，SCAD-siRNA在大脑中显示出更广泛的分布和更强的荧光信号，并成功敲低了脑和脊髓中的Htt mRNA水平。这表明ACO的偶联确实增强了siRNA在CNS中的分布和活性。随后，团队对SCAD的各个组件进行了系统性的结构-活性关系（SAR）优化。他们构建了一个庞大的ACO库，变量包括序列背景、核苷酸组成、长度（6-20 nt）、PS修饰数量、2'糖修饰比例（2'-MOE与2'-O-甲基[2'-OMe]）以及连接子类型（线性如C3, C12, S9, S18；环状如TT二核苷酸）。他们建立了两种关键的体外筛选方法：细胞外蛋白结合实验（通过电泳迁移率变动分析EMSA评估与血浆蛋白的结合能力）和体外自由摄取实验（在原代小鼠肝细胞PMHs中不依赖转染试剂直接加入SCAD-siRNA，评估其基因沉默效率）。研究发现，ACO的核苷酸组成（如富含鸟嘌呤G）、长度（14 nt最佳）、高PS修饰含量以及特定的连接子（如S9）能显著增强蛋白结合和细胞摄取活性。有趣的是，蛋白结合能力与体外敲低活性在不同类型的ACO变体中相关性不一，提示除了蛋白结合，细胞内化过程也可能受其他因素影响。

经过体外筛选获得的优选SCAD候选物（如富含尿苷的ACO、具有S9连接子的ACO^MOE14）在小鼠i.c.v.给药后得到了体内验证。这些优选候选物在脑和脊髓中均表现出显著优于非优化候选物的基因沉默效果，特别是在脊髓中敲低效果强劲，而不佳的设计（如减少PS修饰数量）则几乎完全丧失了活性。这证实了体外筛选方法对于预测体内效率的有效性。

为了深入评估SCAD-siRNA的长期效力和药代动力学（PK）/药效学（PD）特性，研究人员进行了一项长达154天（约5个月）的小鼠实验。单次i.c.v.注射SCAD-siSod1-3（靶向超氧化物歧化酶1）后，其在CNS各区域（包括大脑皮层、小脑、脑干、海马体等下丘脑等深部脑区）的分布远比普通siRNA更广泛、更持久。与之相应，SCAD-siSod1-3在所有检测的CNS区域均诱导了深刻且持久的基因敲低，峰值敲低效率超过80%，并且在给药154天后，在多个脑区仍能维持超过30%的敲低效果。而普通siRNA仅在靠近注射点的区域（如海马体）有短暂且较弱的效应。SCAD-siRNA在血浆中清除迅速，1天后即降至检测限以下，这有助于减少外周暴露，提高安全性。组织中的siRNA浓度与体内活性呈强相关，进一步证实了其良好的PK/PD关系。

SCAD平台的一个重要优势是其细胞类型靶向的广泛性。研究人员合成了靶向星形胶质细胞特异性基因胶质纤维酸性蛋白（Gfap）、小胶质细胞特异性基因离子钙结合适配器分子1（Iba1）和神经元特异性基因微管蛋白β3-III类（Tubb3）的SCAD-siRNA。在小鼠i.c.v.或大鼠鞘内（IT）给药后，这些SCAD-siRNA均能有效降低其各自靶标在CNS中的mRNA水平，表明SCAD能够将功能性的siRNA递送到CNS中的多种细胞类型，这对于治疗涉及多种细胞类型相互作用的复杂神经退行性疾病（如ALS）至关重要。

除了CNS，SCAD平台还展现出向其他肝外组织局部递送的潜力。通过气管内滴注递送至肺部、通过关节内注射递送至关节、以及通过玻璃体内注射递送至眼部，SCAD-siRNA均表现出比普通siRNA更强效和特异的基因沉默效果，且在这些局部给药后，未在非靶标组织（如肝脏或对侧眼）检测到显著活性，证明了其局部作用的特性。

在安全性方面，评估结果显示SCAD-siRNA具有良好的耐受性。单次i.c.v.给药后，小鼠CNS中神经炎症标志物（Iba1, Gfap）的表达水平在长达154天的观察期内无显著变化。在大鼠IT给药毒性试验中，未发现与治疗相关的死亡率、体重下降或临床异常迹象，血液学、血清生化及脑脊液蛋白水平均在正常范围内。功能观察组合（FOB）测试仅在高剂量组个别动物中观察到轻微且非剂量依赖性的神经肌肉功能变化。组织病理学检查发现的少数轻微病变被认为与注射程序相关或为偶发事件。小鼠静脉注射急性毒性试验也未引起显著的细胞因子释放或免疫相关基因的广泛激活。

本研究为开展相关实验所采用的关键技术方法主要包括：利用固相合成法制备所有寡核苷酸（包括SCAD复合物），并通过高效液相色谱和质谱进行纯度和结构鉴定；通过电泳迁移率变动分析（EMSA）评估SCAD结构与血浆蛋白的结合能力；分离培养原代小鼠肝细胞（PMHs）并进行无转染试剂的自由摄取实验，以评估SCAD-siRNA的体外递送效率；使用包括C57BL/6J小鼠和Sprague-Dawley大鼠在内的啮齿类动物模型，通过多种局部给药途径（如侧脑室i.c.v.、鞘内IT、气管内、关节内、玻璃体内注射）进行体内药效和药代动力学研究；采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测靶基因mRNA表达水平，使用茎环RT-qPCR绝对定量组织中的siRNA浓度；并通过临床观察、功能观察组合（FOB）、血清生化、细胞因子检测和组织病理学分析等进行安全性评价。

SCAD架构的构建与体内概念验证

研究人员首先成功构建了SCAD的基本架构，即通过连接子将ACO与双链RNA的乘客链相连。在新生小鼠中的概念验证实验表明，与未偶联ACO的siRNA相比，SCAD-siRNA（Cy3-siHtt-ACO^MOE18）在i.c.v.注射后在大脑中分布更广泛，并能有效敲低脑和脊髓中的靶基因（Htt）mRNA。ACO的长度影响活性，12 nt的ACO无效，而15 nt和18 nt的ACO有效。

SCAD优化与体外评价

通过建立体外蛋白结合实验（EMSA）和原代肝细胞自由摄取实验，研究人员发现ACO的偶联（siSod1-2-ACO^MOE14）显著增强了siRNA与血浆蛋白的结合，并促进了其在不依赖转染试剂情况下的细胞摄取和基因沉默活性，而转染条件下两者活性无差异，说明ACO主要影响递送过程而非RNAi机制本身。

SCAD库开发与构效关系优化

通过构建包含不同核苷酸组成、长度、PS修饰数、2'修饰比例和连接子类型的庞大ACO库，并进行系统的SAR分析，发现富含鸟嘌呤（G）、较长（14 nt）、高PS修饰以及使用S9或TT等线性连接子的ACO设计通常具有更强的蛋白结合和/或体外活性。蛋白结合与体外活性的相关性因ACO类型而异。

体内CNS敲低活性验证

优选出的SCAD候选物（如ACO^G(4), ACO^MOE14, S9-ACO^MOE14）在小鼠i.c.v.给药后，在脑和脊髓中显示出强劲的基因敲低效果，验证了体外筛选的预测价值。减少ACO的PS修饰会几乎完全丧失活性，而将S9连接子两侧的磷酸二酯（PO）键替换为PS键虽意图增强稳定性，却导致脊髓活性下降和肝脏非预期活性增加。

SCAD实现广泛的CNS分布及持久活性

长期（154天）PK/PD研究显示，单次i.c.v.给予SCAD-siSod1-3后，其在CNS各区域的分布远优于普通siRNA，且能诱导深刻（峰值>80%）和持久（>5个月仍>30%）的基因沉默。siRNA组织浓度与敲低活性强相关。SCAD-siRNA在血浆中清除迅速，减少了外周暴露。

CNS中SCAD-siRNA的细胞类型特异性

SCAD平台能够有效递送siRNA至CNS中的不同细胞类型，包括神经元（靶向Tubb3, Map2）、星形胶质细胞（靶向Gfap）和小胶质细胞（靶向Iba1），表明其具有广泛的细胞靶向能力。

SCAD向其他肝外组织（肺、关节、眼）的递送

通过局部给药（气管内、关节内、玻璃体内），SCAD-siRNA在肺、关节滑膜和眼视网膜组织中均表现出比普通siRNA更高效和特异的基因沉默，且无明显系统性暴露，展示了其在治疗肝外疾病方面的应用潜力。

SCAD的安全性和毒理学评价

综合评估表明SCAD-siRNA在CNS内未引起显著神经炎症反应。在大鼠IT给药和小鼠静脉给药急性毒性实验中，SCAD-siRNA表现出良好的安全性和耐受性，临床观察、体重、血液学、血清生化、细胞因子和免疫基因激活等指标均未发现严重的、剂量依赖性的毒性反应。个别轻微的组织学变化被认为与操作相关或为偶发。

本研究开发的SCAD递送平台，巧妙地利用经过优化的单链ACO来增强双链RNA的成药性，成功克服了其向CNS及其他肝外组织有效递送的主要障碍。该平台的核心优势在于其模块化设计，可通过固相化学合成快速制备，易于适应任何双链RNA序列，具有良好的可扩展性和成本效益。研究表明，经过优化的SCAD架构能够实现siRNA在CNS中的广泛分布和长达数月的持久基因沉默，并且能够靶向神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞等多种与神经退行性疾病病理相关的细胞类型。此外，SCAD在肺、关节和眼等组织的局部递送中也展现出高效性。综合安全性评价支持其具有良好的耐受性。与现有的CNS递送策略（如C16-脂质偶联siRNA或TfR1靶向的AOC）相比，SCAD在提供相当或更优的递送效率的同时，可能具有合成更简单、潜在毒性更低等优势。该研究成果不仅为治疗ALS、阿尔茨海默病、亨廷顿病等CNS疾病提供了强有力的新工具，也为开发针对其他肝外组织疾病的RNAi疗法开辟了新途径。基于SCAD平台的候选药物RAG-17已进入治疗SOD1-ALS的临床试验阶段，其临床结果将进一步验证该平台的转化前景。