人多能干细胞分化中Perturb-seq技术的优化与调控网络解析

《Stem Cell Reports》：Benchmarking and optimizing Perturb-seq in differentiating human pluripotent stem cells

本研究针对Perturb-seq技术在干细胞分化系统中应用的技术挑战，通过系统优化CRISPRi工具、sgRNA递送方法和实验流程，建立了稳定高效的hPSC分化平台。研究人员在心肌细胞分化过程中成功解析了199万+细胞的转录组数据，揭示了NKX2-5等心脏转录因子与下游靶基因的调控网络，为发育生物学和疾病机制研究提供了重要技术资源和理论基础。

　　

在干细胞生物学和发育研究领域，科学家们一直致力于解析基因和调控元件在细胞命运决定过程中的功能。传统方法往往只能针对单个基因或有限数量的靶点进行研究，难以系统揭示复杂的基因调控网络。近年来出现的Perturb-seq技术将CRISPR基因编辑与单细胞RNA测序相结合，为大规模功能基因组学研究带来了革命性突破。然而，这项技术在干细胞分化系统中的应用却面临着诸多技术瓶颈。

人多能干细胞(hPSC)具有分化为各种人体细胞类型的潜力，为研究人类发育和疾病提供了理想模型。但在实际应用中，hPSC存在转基因沉默、分化异步等问题，导致Perturb-seq实验结果不稳定、成本高昂。特别是在长达数周的分化过程中，如何维持基因扰动效果的稳定性成为技术难点。此外，干细胞分化产生的细胞状态连续性也增加了数据分析的复杂性。

针对这些挑战，德克萨斯大学西南医学中心的研究团队在《Stem Cell Reports》上发表了他们的解决方案。他们通过系统优化建立了稳定高效的Perturb-seq技术平台，并在心肌细胞分化模型中解析了关键转录因子与下游靶基因的调控网络。

研究团队采用的主要技术方法包括：通过基因编辑技术在CLYBL和ROSA26等基因组安全港位点稳定整合dCas9-KRAB表达框；比较评估慢病毒、PiggyBac转座子和PA01重组酶三种sgRNA递送策略；利用单细胞转录组测序分析199万多个细胞；通过WTC11 iPSC和H9 ESC两种人多能干细胞系进行方法验证；在心肌细胞和神经祖细胞分化过程中进行功能验证。

工程化多功能多能干细胞用于多样化Perturb-seq应用

研究人员首先构建了稳定表达CRISPRi machinery的干细胞系。他们在H9胚胎干细胞和WTC11诱导多能干细胞中，通过TALEN介导的基因编辑将dCas9-KRAB整合到CLYBL基因组安全港位点，建立了组成型表达的H9 dCK和WTC11 dCK细胞系。同时，他们还构建了四环素诱导型的H9 idCK细胞系，将rtTA激活剂盒整合到ROSA26位点，将TRE-dCas9-KRAB整合到CLYBL位点。这种双靶向策略确保了转基因的独立表达且互不干扰。

通过qPCR实验验证，这些工程化细胞系在干细胞状态和心肌细胞分化过程中均能实现80%-95%的靶基因抑制效率。研究人员设计了针对193个心脏基因启动子和增强子的sgRNA文库，在心肌细胞分化过程中进行Perturb-seq实验，发现WTC11细胞的CRISPRi抑制效率达到约70%，H9细胞约为60%。特别是对心脏关键转录因子NKX2-5的抑制，在所有工程化细胞系中均能降低70%-80%的转录水平。

比较sgRNA递送方法以优化靶基因抑制

研究团队系统比较了三种sgRNA递送策略：慢病毒载体、PiggyBac转座子和PA01重组酶系统。他们设计了U6-sgRNA-EF1α-mTagBFP-puro载体结构，将sgRNA表达框置于选择标记基因上游，以确保sgRNA的最佳表达和有效捕获。

实验结果显示，慢病毒和PiggyBac递送在H9 dCK和WTC11 dCK细胞中均能实现80%-90%的靶基因抑制，而PA01重组酶系统的抑制效率相对较低(54%)。研究人员发现，这可能与AAVS1位点的sgRNA表达水平较低有关。值得注意的是，PA01系统的优势在于能够实现位点特异性整合，并允许在同一细胞中测试多个sgRNA组合。

Perturb-seq优化提高命中发现并降低成本

研究团队实施了一系列优化措施以提高实验效率并降低成本。在sgRNA设计方面，他们评估了FlashFry、CRISPR designer和全基因组BLAST等多种预测工具，发现约70%的sgRNA能够实现有效抑制(>50%抑制率)，但不同设计方法间存在显著差异，提示需要测试多个sgRNA以确保命中率。

为维持sgRNA库的复杂性，研究人员开发了通过纳米孔测序仪动态监测sgRNA分布的策略。这一质量控制步骤能够在分化过程中及时发现克隆扩张问题，确保实验数据的可靠性。此外，通过荧光激活细胞分选富集BFP阳性细胞、优化细胞超载技术等措施，使每个10x测序通道的单细胞回收量从2万提高到4万，显著降低了实验成本。

Perturb-seq过程中的克隆扩张

研究团队设计了针对64个跨谱系表达转录因子的sgRNA文库，在WTC11 dCK细胞的心肌细胞和神经祖细胞分化过程中进行Perturb-seq实验。结果显示，TP53的抑制在所有三种细胞类型( iPSC、CM和NPC)中均引起显著的克隆扩张，这与TP53作为肿瘤抑制因子的功能一致。通过计算分析去除克隆扩张的影响后，研究人员发现16个TF在三种细胞类型中均能引起转录组变化，其中6个TF在所有谱系中均被有效抑制。

跨基因、增强子和干细胞的调控网络比较分析

通过分析转录因子扰动引起的全局基因表达变化，研究人员构建了心脏发育过程中的基因调控网络。他们发现，NKX2-5和TBX20的扰动引起高度相似的转录组变化，共有146个基因程序重叠，提示这两个因子在心脏发育中可能存在协同作用。相反，TBX20和TBX5的扰动相关性较低，表明它们在心脏发育中可能具有 distinct 功能。

特别值得注意的是，SOX17和GRHL2的扰动引起的转录组变化与已知心脏转录因子(NKX2-5、TBX20、TBX5)呈负相关，这与SOX17在内胚层分化中的关键作用一致。研究人员还发现，TBX5、NKX2-5、TBX20、GATA4或NKX2-6的CRISPRi抑制均能调控已知心脏转录因子IRX4的表达，这与先前小鼠研究中这些因子在心室发育过程中调控IRX4的结果一致。

解析NKX2-5抑制的下游效应物

研究数据揭示了一个新的调控联系：在心肌细胞分化过程中，NKX2-5的CRISPRi抑制导致NRG1的显著上调。这种调控具有特异性，因为TBX5或IRX4的抑制不会显著上调NRG1表达。通过生成H9 NKX2-5 CRISPRi胚胎干细胞并分化为心肌细胞，研究人员验证了多个心脏基因的表达改变，包括离子通道(RYR2和KCNH7)、肌节蛋白(TNNT2)、信号配体(BMP4)以及心室发育调节因子(HEY2和FHL2)。

特别值得注意的是，心脏祖细胞发育中的重要转录因子SIX1在NKX2-5抑制后表达上调，这与Nkx2-5缺陷小鼠心脏过度小梁化的表型一致。另一个心脏发育关键因子ISL1也在NKX2-5 CRISPRi细胞中上调，证实了NKX2-5对ISL1的直接抑制作用。这些发现支持了NKX2-5通过抑制NRG1表达来确保适当的小梁形成和心室发育的假设。

研究结论与意义

本研究系统优化了Perturb-seq技术在干细胞分化系统中的应用，建立了稳定高效的实验平台。通过工程化改造干细胞系、优化sgRNA递送策略、实施严格的质量控制步骤，研究人员成功克服了hPSC中转基因沉默、分化异步等技术难题。这些优化使大规模Perturb-seq实验在干细胞分化模型中的成本显著降低，数据质量大幅提高。

更重要的是，研究团队利用这一平台解析了心脏发育过程中的关键调控网络，特别是揭示了NKX2-5与NRG1之间的新型调控关系。这一发现为理解心室发育异常疾病的分子机制提供了重要线索。研究中建立的标准化操作程序、工程化细胞系和实验方案已通过IGVF联盟共享给科学界，为功能基因组学研究提供了宝贵资源。

该研究的创新之处在于首次系统评估了不同CRISPRi模式、基因组靶标、干细胞系和sgRNA递送系统在分化背景下的性能，为未来基于干细胞的功能基因组学研究设立了新标准。这些工具和方法的建立将加速对发育生物学和疾病机制的理解，特别是在心脏发育和先天性心脏病研究领域具有重要应用价值。