综述：利用iPSC衍生模型模拟腓骨肌萎缩症2A型的进展与挑战

《Stem Cell Reports》：Advances and challenges in modeling Charcot-Marie-Tooth type 2A using iPSC-derived models

本综述系统总结了利用诱导多能干细胞（iPSC）衍生模型研究由MFN2基因突变引起的腓骨肌萎缩症2A型（CMT2A）的最新进展。文章重点探讨了iPSC衍生运动神经元（MN）和感觉神经元（SN）模型在揭示疾病病理机制（如线粒体动力学异常、轴突运输缺陷）方面的独特价值，并评估了多种潜在治疗策略（如mitofusin激动剂、SARM1抑制剂、HDAC6抑制剂、基因治疗等）的应用前景与挑战，为CMT2A的精准医疗和药物开发提供了创新平台。

　　

利用iPSC衍生模型体外模拟运动神经元和感觉神经元

多种方法被用于生成携带CMT2A相关MFN2突变的iPSC衍生MN和SN。所有方法都始于将患者细胞重编程为iPSC并诱导神经命运，但它们在关键技术上存在差异，例如贴壁培养与聚集体培养、神经元富集方法以及MN或SN的特化。首个患者衍生模型由Saporta等人于2015年描述，该研究将皮肤成纤维细胞重编程为iPSC，并采用基于L1CAM的磁珠分选来富集MN。随后，Rizzo等人应用了多阶段贴壁方案，结合自发神经化与尾腹侧特化，并通过离心梯度分离进行MN富集。与之相反，Ohara等人使用基于拟胚体（EB）形成的悬浮方案来诱导MN。最后，Van Lent等人通过双SMAD抑制方案从iPSC生成了MN和SN，并在分化末期添加阿糖胞苷以增强MN和SN群体的纯度。

MFN2^R364W iPSC衍生的运动神经元

2015年，Saporta及其同事首次通过将一名携带MFN2基因p.R364W突变的CMT2A患者的皮肤成纤维细胞重编程为iPSC，进而分化出脊髓MN。分析显示，CMT2A MN表现出正常的形态，但轴突中线粒体运动显著减慢，且电生理评估显示静息膜电位超极化、钠电流密度增加和通道失活受损，表明神经元兴奋性增加，这可能是治疗干预的潜在靶点。

MFN2^A383V iPSC衍生的运动神经元

Rizzo等人于2016年从两名携带p.A383V MFN2突变的CMT2A同胞的iPSC生成了MN。受累MN表现出线粒体含量全局性减少、线粒体运输减少和核周线粒体聚集。RNA测序分析发现p53依赖性凋亡通路下调，而蛋白质组学研究揭示了自噬和线粒体自噬清除通量的上调。作者推测，p53下调诱导的线粒体自噬增加可能是导致突变MFN2 MN中线粒体大量减少的主要致病机制。

MFN2^H128Y 和 MFN2^R94Q iPSC衍生的运动神经元

Ohara等人于2017年从携带p.R94Q和p.H128Y MFN2突变患者的iPSC生成了MN。他们观察到神经突内线粒体长度变短，形态异常，且移动线粒体的百分比显著降低。此外，神经突内ATP水平和线粒体数量减少，表明存在线粒体功能障碍。CMT神经元对短期暴露于神经毒性药物（如长春新碱）表现出更高的敏感性，提示抗癌药物可能通过诱导线粒体应激导致神经病变。

MFN2^R94Q iPSC衍生的运动和感觉神经元

Van Lent等人于2021年从MFN2^R94Q iPSC系生成了MN和SN。患者MN表现出神经突长度和网络显著减少，并与微电极阵列实验检测到的高连接性相关。同时，线粒体形态、轴突运输和氧化磷酸化存在缺陷。RNA测序显示呼吸链、轴突导向和PI3K-Akt通路富集。从相同iPSC分化出的SN也显示出神经突长度显著减少，以及线粒体和溶酶体速度的进行性下降及形态改变。这些发现证明了MN和SN中均存在进行性线粒体功能障碍。值得注意的是，通过CRISPR/Cas9技术生成的同基因MFN2^ISO系获得的表型拯救，支持了这些是疾病的真实标志。

iPSC用于CMT2A建模的优势与局限性

iPSC衍生模型阐明了传统动物模型或原代细胞培养未能完全重现的致病机制。人类iPSC模型的物种特异性优势尤为重要，因为线粒体代谢和轴突运输机制在小鼠和人类之间存在显著差异。不同的MFN2突变在iPSC衍生模型中导致不同的细胞表型，iPSC技术允许进行患者特异性建模，从而能够在人类细胞环境中研究特定突变效应。使用同基因对照（例如通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术）是一种方法学进步，可加强观察到的表型与MFN2突变之间的因果关联。

然而，iPSC衍生模型存在局限性。最主要的挑战之一是未能充分重现患者特征性的长度依赖性“逆行性”轴突变性。iPSC衍生神经元的神经突相对较短（通常100-500微米），无法完全复制体内长轴突面临的生物能量应激和运输挑战。此外，大多数模型缺乏雪旺细胞等支持细胞类型，可能遗漏与轴突-胶质相互作用相关的重要发病机制。当前模型也难以模拟周围神经的三维结构和经历的机械应力。神经元前体细胞（NPC）是研究周围神经病变早期线粒体功能障碍出现的有价值模型系统。此外，建立功能性MN和SN的标准方案以及表型表征的共识指南对于推动领域发展和制定有效治疗策略至关重要。

治疗开发的见解

CMT2A的治疗策略已从靶向个体通路发展到识别不同CMT2亚型间的共同机制。iPSC模型已成为理解和临床前评估的关键平台。

Mitofusin激动剂是最具机制针对性的方法，旨在解决MFN2突变引起的线粒体融合缺陷。研究表明，这些化合物能逆转CMT2A iPSC衍生MN中的线粒体异常。尽管临床前结果充满希望，但长期安全性、最佳给药窗口狭窄以及向周围神经的递送问题限制了其立即临床转化。

SARM1抑制靶向轴突变性的最终共同通路。小分子SARM1 NADase抑制剂（如DSRM-3716）能有效防止CMT2A患者iPSC衍生MN的轴突变性。主要担忧在于阻断这一重要细胞过程可能带来的意外后果。

HDAC6抑制通过恢复α-微管蛋白乙酰化来改善轴突运输缺陷。该方法在多种CMT模型和相关神经退行性疾病中显示出一致的疗效，且治疗窗口相对较宽。然而，HDAC6具有多种细胞功能，长期治疗可能存在脱靶效应风险。

DLK（双亮氨酸拉链激酶）抑制靶向应激响应的JNK信号通路。DLK抑制剂在MFN2^R94Q MN中显示出部分恢复线粒体形态和活性的前景。但长期抑制可能破坏正常的应激反应和适应性机制。

基因治疗是直接针对遗传缺陷的方法。Rizzo等人开发了一种结合RNA干扰（RNAi）和基因替代的联合方法，在体外和体内均成功验证了其拯救CMT2A表型的能力。此外，MFN1过表达也被证明可以在不靶向突变蛋白的情况下挽救多种CMT2A表型，可能适用于不同的MFN2突变类型。

局限性与未来展望

除了识别有希望的治疗靶点，将iPSC模型用于治疗筛选还需要开发强大、可扩展的读数系统。高内涵成像平台已成为特别有价值的工具。中通量方法通常关注疾病特异性读数。将多电极阵列与iPSC衍生神经元培养相结合，可提供网络活动的功能性读数。

近年来，先进的患者特异性iPSC培养系统，如微流控芯片、类器官和组装体，已成为高度通用和强大的疾病建模和临床前研究平台。这些复杂的系统能更真实地模拟人类组织的复杂环境，提供了克服传统2D模型局限性的宝贵工具。特别是类器官，它们是源自iPSC或胚胎干细胞（ESC）的3D微型自组织结构，能够概括器官的生物学结构。组装体进一步增强了复杂性，它整合了多种类器官类型以更好地模拟不同组织间的相互作用。引入血管系统以促进营养和药物运输可以进一步增强类器官/组装体的生长和整体功能。

尽管iPSC衍生模型存在固有局限性，但它们已显著影响了对CMT2A潜在细胞机制的理解。未来的发展可能集中在创建更复杂的多细胞模型，结合神经元、雪旺细胞和支持细胞类型，并可能结合机械刺激系统以更好地模拟周围神经的体内生物力学环境。将iPSC技术与尖端遗传工程、多组学分析和数据科学相结合，有望加速对疾病病理生理学的理解并推动治疗开发。实施精准医疗策略，利用患者特异性iPSC模型为个体化治疗干预提供信息，对推进CMT2A的个性化护理具有重大前景。