记忆印迹突触的3D分子架构通过cryoCLEM引导的cryoET实现可视化

《Structure》：Memory engram synapse 3D macromolecular architecture visualized by cryoCLEM-guided cryoET

本刊推荐：记忆如何存储于大脑是神经科学的核心问题。Ryan团队为解析记忆印迹（engram）突触的原位分子结构，开发了“印迹至断层图”工作流程，将活动依赖性遗传标记与低温相关光电子显微镜（cryoCLEM）引导的低温电子断层成像（cryoET）相结合，首次在新鲜脑组织中可视化恐惧记忆印迹突触的三维分子架构，揭示了其大分子组成和细胞器的异质性，为理解记忆存储的物理基础提供了新视角。

　　

记忆是大脑最神奇的功能之一，它让我们能够回忆过去的经历、学习新知识并规划未来。但记忆究竟是如何在大脑中存储的？这个问题的答案困扰了科学家数十年。早在20世纪初，心理学家Richard Semon就提出了“印迹”（engram）的概念，认为记忆是由特定神经元群体（即印迹细胞）的物理化学变化所编码的。这些印迹细胞通过突触连接形成复杂的神经环路，当经历某个事件时，这些环路的连接强度会发生改变，从而存储信息。

随着技术的发展，科学家已经能够通过活动依赖性遗传标记技术来识别和操纵这些印迹细胞。研究表明，记忆的形成确实与印迹细胞之间突触连接的强化有关。然而，一个根本性问题仍未解决：在分子水平上，存储记忆的印迹突触到底长什么样？它们的分子组成和三维结构有何特征？传统电子显微镜技术虽然能够显示突触的形态，但无法在原生状态下解析单个蛋白质分子的结构。而冷冻电子断层成像（cryoET）技术虽然能够以近原子分辨率观察生物大分子的原生结构，但如何在海量脑组织中精准定位那些稀疏分布的、存储特定记忆的印迹突触，却是一个巨大挑战。

为了攻克这一难题，由Charlie Lovatt、Clara Ortega-de San Luis、Tomás J. Ryan和René A.W. Frank等科学家组成的研究团队在《Structure》杂志上发表了他们的最新成果。他们成功开发了一种名为“印迹至断层图”（engram to tomogram）的创新工作流程，首次实现了对特定记忆印迹突触原位三维分子架构的可视化。

研究人员为开展这项研究，整合了多项前沿技术。他们利用活动依赖性遗传标记技术，在小鼠海马CA3和CA1区特异性标记了一个情境恐惧记忆的印迹细胞。通过急性脑片制备、高压冷冻技术保存样本的原生状态，再结合低温超薄切片、低温荧光显微镜（cryoFM）进行目标定位，最终使用cryoCLEM引导的cryoET技术，成功采集了印迹突触的断层图像数据。

CryoCLEM-guided cryoET of engram synapse

研究团队首先建立了一套完整的工作流程，将印迹标记技术与cryoCLEM和cryoET相结合。他们通过向小鼠CA3区注射AAV9-c-fos-tTA/TRE-ChR2-EYFP，向对侧CA1区注射AAV9-c-fos-tTA/TRE-mCherry，来标记参与情境恐惧记忆的印迹细胞。在移除多西环素（DOX）后，让小鼠接受情境恐惧条件化训练，从而特异性标记存储该记忆的突触前CA3神经元和突触后CA1神经元。

通过免疫荧光实验，研究人员验证了ChR2-EYFP确实标记了CA3神经元的突触前终末，而mCherry则与突触后密度蛋白95（PSD95）共定位，确认了标记的特异性。随后，他们从训练后5-6天的小鼠制备急性海马脑片，通过高压冷冻保存样本的原生状态，再制备70-150纳米厚的玻璃态冷冻切片。

Quantification of engram-labeled synapses

通过对13个印迹突触的断层图进行分析，研究人员系统量化了各种大分子成分和细胞器的分布。他们发现，细胞内区域占据了断层图体积的约74%，细胞外间隙的直径在7-307纳米之间，与之前cryoET研究的结果一致，表明组织结构保存良好。

在突触前终末中，研究人员观察到了典型的突触小泡，其平均直径为41.6±11.7纳米，纵横比接近1，说明大多数小泡在切片过程中保持了较好的球形。他们还发现了一群椭圆形的突触小泡，这可能代表了一类真正的突触小泡亚群。突触小泡在距离突触前膜不同区域的分布没有显著差异，这与在原代神经元中的观察结果相似。

线粒体是突触中重要的细胞器，85%的印迹突触中都含有线粒体，其中58%位于突触后区域。考虑到树突棘中很少含有线粒体，这些含有突触后线粒体的突触很可能对应于树突干上的突触。研究人员还观察到线粒体内存在钙磷酸盐沉积，这可能在突触钙信号调节中发挥作用。

在突触后区域，F-肌动蛋白（F-actin）细胞骨架形成了分支网络，其拷贝数在不同突触间存在3倍的变化，表明细胞骨架结构的多样性。这些F-actin网络对于突触可塑性至关重要，特别是在树突棘的形态变化中扮演关键角色。

突触间隙的高度是影响突触传递效率的重要因素。研究人员测量了突触间隙的高度，发现不同印迹突触的平均间隙高度在12-35纳米之间变化，范围大于传统化学固定和重金属染色电子显微镜研究报道的结果。部分突触的间隙高度分布呈双峰模式，表明间隙内存在不同的亚区域。跨突间隙的蛋白质复合物的高度分布与间隙高度相似，提示这些粘连蛋白可能参与调节局部间隙高度。

研究人员还鉴定了三类突触间隙内的重复密度：跨突触粘连蛋白、“Y”形的突触后蛋白和“L”形的突触前蛋白。这些密度与已知的间隙蛋白一致，但由于数量不足，无法通过亚断层图平均来精确识别具体成分。

Cell-specific cryoCLEM-guided cryoET

为了测试该方法的普适性，研究人员还收集了仅标记突触前或突触后神经元的突触断层图。当仅使用ChR2-EYFP标记CA3突触前终末时，cryoCLEM引导的cryoET仍能准确定位含有突触小泡的突触前终末。同样，当使用泛神经元标记（CaMKII-ChR2-EYFP）标记CA3神经元，同时使用印迹标记（TRE-mCherry）标记CA1神经元时，也能成功获得特定突触的分子分辨率断层图。这些实验进一步证明了该工作流程在标记不同神经元群体方面的灵活性。

这项研究通过建立“印迹至断层图”工作流程，首次揭示了记忆印迹突触的原位三维分子架构。研究发现，印迹突触在分子组成和结构上表现出显著的异质性，包括细胞器分布、突触小泡排列、F-肌动蛋白网络和突触间隙高度等方面的多样性。这种结构多样性可能反映了不同类型突触的功能特性，也可能是记忆存储的物理基础。

该研究的意义在于，它架起了连接动物行为与神经元环路中蛋白质分子结构的桥梁，为在分子水平上理解记忆存储机制提供了全新视角。未来，通过扩大数据集，结合时间序列分析，研究人员可能能够揭示在记忆编码、巩固和提取的不同阶段，印迹突触结构发生的动态变化。此外，该方法还可应用于研究发育、衰老、应激以及神经精神疾病和神经退行性疾病模型中印迹突触的结构变化，为理解这些条件下记忆功能障碍的分子基础提供新线索。

总之，这项研究不仅展示了在复杂脑组织中解析特定功能突触分子结构的能力，也为未来研究记忆和其他大脑功能的物理化学基础奠定了方法学基础。随着技术的进一步发展和自动化，我们有望在更深层次上揭示大脑存储记忆的奥秘。