成纤维细胞生长因子信号诱导衰老过程中外周神经成纤维细胞向软骨样状态转化

《Nature Communications》：Fibroblast growth factor signaling induces a chondrocyte-like state of peripheral nerve fibroblast during aging

本刊推荐：为阐明外周神经(PNS)衰老的分子机制，研究人员通过单核转录组测序(snRNA-seq)分析了小鼠坐骨神经，揭示了巨噬细胞(Mφ)亚型动态变化，并发现脂肪细胞来源的FGF2信号可激活衰老的人神经束膜成纤维细胞(hPnFbs)表达SOX9/FOXC2，形成软骨样状态；该过程可被FGF1阻断，为干预神经退行性病变提供了新靶点。

　　

随着全球人口老龄化加剧，与年龄相关的神经功能退化已成为严重影响生活质量和疾病风险的重要因素。其中，外周神经系统（PNS）的衰老会导致神经传导速度下降、靶器官（如骨骼肌、心脏和肠道）功能受损。尽管人们已经观察到衰老的外周神经会出现细胞丢失、细胞外基质（ECM）沉积增加（例如软骨蛋白聚糖的积累）等现象，但其背后的具体分子机制却一直模糊不清。是否存在关键的信号通路在驱动这些有害的变化？这正是本研究致力于揭示的核心科学问题。

以往的研究表明，衰老会导致心脏、肺和肝脏等器官出现纤维化，这与成纤维细胞的异常激活有关。此外，衰老还与其他细胞类型的表型转变相关，例如在血管钙化过程中，血管平滑肌细胞会转变为成骨细胞样细胞。特别值得注意的是，成纤维细胞生长因子（FGF）信号通路在年龄相关的疾病中扮演着复杂角色，它参与调控脂肪沉积、纤维化甚至钙化过程。更有趣的是，FGF信号在软骨细胞分化中起着关键的诱导作用。那么，FGF信号是否也参与了外周神经的衰老进程？它是否会促使神经内的成纤维细胞发生某种不利于神经功能的细胞状态改变？

为了回答这些问题，由Dragana Stefanovska、Sebastian Preissl和Luis Hortells等领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们利用先进的单核RNA测序（snRNA-seq）技术，绘制了小鼠坐骨神经在不同年龄点（2-3个月、15-16个月和20-30个月）的细胞图谱，深入解析了衰老过程中神经内细胞组成和基因表达的动态变化。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术：首先，他们对不同年龄段小鼠的坐骨神经进行了单核RNA测序（snRNA-seq），并利用生物信息学工具（如Seurat、Harmony）进行细胞聚类分析和细胞类型注释；其次，他们采用计算生物学方法（CellChat软件）预测了神经内不同细胞群体之间的配体-受体相互作用网络；再次，他们利用免疫荧光染色技术在蛋白水平上验证了snRNA-seq的发现，并对人手术标本（包括副神经、腓肠神经、股神经、舌下神经和尺神经，供体年龄从17岁至68岁）进行了分析；最后，他们建立了体外细胞模型，使用衰老的人神经束膜成纤维细胞（hPnFbs）来探究FGF2和FGF1对细胞表型的影响。

研究结果

Sciatic nerve snRNA-seq reveals age-related signatures in different cell types

通过对19,175个高质量细胞核进行分析，研究团队鉴定出19个细胞簇，包括神经内膜成纤维细胞、脂肪组织细胞、与运动神经元相关的髓鞘形成施万细胞（mSC）、神经束膜成纤维细胞（PnFbs）、巨噬细胞（Mφ）、B细胞、内皮细胞等多种细胞类型。分析发现，脂肪细胞和一种特殊的“软骨样状态”成纤维细胞的比例随年龄增长而显著增加。特别值得注意的是，髓鞘形成施万细胞（表达S100B）的减少在衰老早期（15-16个月）就已出现。

Changes in sciatic nerve Mφ profile during aging

对巨噬细胞群的深入分析揭示了六种亚型：神经内膜、神经外膜、循环来源的慢性炎症型、循环来源1型和循环来源2型巨噬细胞。研究发现，巨噬细胞的表型随衰老呈动态变化：在衰老起始阶段（15-16个月），具有吞噬功能的巨噬细胞数量增多；而在晚期衰老阶段（20-30个月），慢性炎症型巨噬细胞则更为 prevalent。免疫荧光染色结果证实，CD45⁺/MRC1⁺ 的稳态巨噬细胞在年轻小鼠神经中更常见，而CD68⁺/GRN⁺ 的吞噬性巨噬细胞在中年小鼠中增多，CD45⁺/TGFβR1⁺ 的慢性炎症巨噬细胞在老年小鼠中显著增加。这表明衰老的神经环境中存在一个促炎状态的发展过程。

During aging, nerve fibroblasts can acquire a chondrocyte-like state

研究发现，一个表达软骨细胞谱系标记物（包括Sox9、Foxc2和Cspg4）的成纤维细胞亚群在衰老过程中显著扩增。功能富集分析表明，该细胞群的功能与“软骨细胞发育”和“软骨细胞分化的正向调控”密切相关。免疫荧光显示，老年小鼠坐骨神经中SOX9⁺ 细胞密度和CSPG4⁺ 面积均显著增加。拟时序分析提示，这种软骨样状态的成纤维细胞最有可能起源于神经束膜成纤维细胞（PnFbs），体内实验也证实老年小鼠神经中SOX9⁺/GLUT1⁺（PnFbs标记）的细胞数量远多于SOX9⁺/KCNC2⁺（神经外膜成纤维细胞标记）的细胞。

During aging, there are increased numbers of FGF2+ adipocytes

细胞间通讯分析（CellChat）预测，在衰老的神经中，脂肪细胞通过FGF信号通路与成纤维细胞（尤其是PnFbs和软骨样状态成纤维细胞）的相互作用增强。Fgf2在脂肪细胞中的表达尤为突出，且其表达量在老年小鼠的脂肪细胞中显著上调。同时，脂肪细胞标志物（如Fabp4和Adipoq）的表达以及脂肪细胞核的数量在衰老神经中也均有所增加。免疫组化结果证实，老年小鼠坐骨神经中FABP4⁺ 脂肪细胞以及FABP4⁺/FGF2⁺ 脂肪细胞的密度显著更高，这些脂肪细胞主要位于神经外膜和神经束膜，为局部相互作用提供了可能。

FGF2, but not FGF1, induces a chondrocyte-like state in senescent hPnFbs

研究的关键发现在于，FGF2对成纤维细胞的作用取决于细胞的衰老状态。在早期传代（健康）的人神经束膜成纤维细胞（hPnFbs）中，FGF2处理并未诱导软骨细胞标志物SOX9和FOXC2的表达，反而表现出一定的保护作用，降低了DNA损伤标志物γH2AX的水平。然而，在复制性衰老（传代8-9代）的hPnFbs中，高浓度FGF2（100 ng/ml）处理可显著诱导SOX9和FOXC2的共表达，即软骨样状态的激活。值得注意的是，FGF1单独处理不能诱导此状态，但当与FGF2共同施加时，高浓度的FGF1能够阻断FGF2的效应。此外，在撤除FGF2刺激后，表达SOX9/FOXC2的细胞数量回落，表明这种细胞状态的改变在初期是可逆的。对老年人外周神经样本的分析显示，与年轻供体相比，年老供体的神经中FGF2⁺ 细胞以及FGF2⁺/SOX9⁺ 细胞的数量显著增加，且总细胞核密度降低，这在一定程度上印证了小鼠模型中的发现。

研究结论与意义

本研究系统性地描绘了外周神经衰老过程中的细胞和分子图谱，揭示了一个此前未被重视的核心机制：衰老环境中，脂肪细胞来源的FGF2信号能够驱动神经束膜成纤维细胞进入一种软骨样状态。这项工作的重要意义在于：

1. 1.
   机制创新性：首次将FGF信号通路、脂肪细胞增多、成纤维细胞状态改变和神经衰老有机地联系起来，提出了“FGF2诱导的软骨样成纤维细胞状态”是驱动神经退行性变化的一个关键环节。
2. 2.
   细胞状态的动态性与可逆性：研究强调这种衰老相关的成纤维细胞状态改变并非不可逆的终末分化，这为开发干预策略带来了希望。撤除FGF2后表型的回退提示，靶向微环境信号可能使衰老的神经组织向更健康的状态逆转。
3. 3.
   治疗靶点的发现：研究发现FGF1能够拮抗FGF2诱导的软骨样状态，这为探索FGF1或其类似物作为延缓外周神经衰老的潜在治疗分子提供了新的思路。
4. 4.
   研究资源的贡献：团队构建了公开可访问的单细胞图谱数据平台，为领域内进一步研究神经衰老提供了宝贵资源。

总之，这项研究不仅深化了我们对周围神经衰老复杂性的理解，更重要的是指明了FGF2/FGF1信号平衡在其中的核心地位，为未来开发促进健康神经老化的新策略奠定了坚实的理论基础。