转录抑制与CAG重复序列直接结合抑制亨廷顿病体细胞不稳定性

《Nature Communications》：Suppression of Huntington’s Disease Somatic Instability by Transcriptional Repression and Direct CAG Repeat Binding

本研究针对亨廷顿病（HD）中突变亨廷顿蛋白（mHTT）降低疗法与体细胞不稳定性（SI）的关联展开探索。通过遗传学、药理学及锌指蛋白（ZFP）等手段，发现靶向DNA的转录 repression 或CAG重复序列直接结合均可显著抑制SI，而胞质作用的siRNA无效。这一发现为HD及其他重复序列疾病提供了新型治疗策略，凸显了DNA靶向疗法的独特优势。

　　

亨廷顿病（Huntington's disease, HD）是一种致命的神经退行性疾病，由亨廷顿基因（HTT）中CAG三核苷酸重复序列异常扩增引起。患者通常在中年出现运动障碍、认知衰退和精神症状，目前尚无根治方法。主流治疗策略聚焦于降低突变HTT（mHTT）的mRNA和蛋白水平，以减轻毒性。然而，近年研究发现，体细胞不稳定性（somatic instability, SI）——即CAG重复序列在体细胞组织中的进一步延长——是驱动HD发病年龄和疾病进展的关键因素。大型全基因组关联研究（GWAS）表明，DNA错配修复（MMR）通路基因的变异可双向调节HD运动症状的发病年龄，且CAG重复序列的连续性（如CAA中断的缺失）会显著加速疾病进程。更引人注目的是，单细胞RNA测序数据提示，真正引发毒性的CAG长度可能远高于遗传获得的长度（如150个重复），而小鼠模型研究也证实，抑制SI能显著延缓病理表型。这些发现引出一个关键问题：现有的mHTT降低疗法是否会影响SI？二者之间存在何种关联？为解答这一问题，本研究系统评估了多种HTT降低手段对HD基因敲入小鼠模型中SI的影响，揭示了转录活性和CAG结合在调控SI中的核心作用。

本研究主要采用以下关键技术方法：

1. 1.
   反义寡核苷酸（ASO）干预：通过每周腹腔注射靶向Htt外显子的ASO，长期抑制肝脏中HTT表达；
2. 2.
   LacO阻遏系统：利用遗传调控的Htt^LacO-Q140/+小鼠模型，通过IPTG调控突变Htt的转录水平；
3. 3.
   CRISPR/Cas9基因编辑：通过AAV8递送gRNA对，删除Htt^Q111/+小鼠中mHTT的启动子区域，实现成年期完全转录沉默；
4. 4.
   siRNA与GalNAc偶联技术：通过皮下注射靶向Htt的siRNA，特异性降低胞质中HTT水平而不影响核内转录；
5. 5.
   锌指蛋白（ZFP）工程化改造：构建全长ZFP（DBD+KRAB）、仅DNA结合域（DBD-only）及仅KRAB结构域的病毒载体，通过脑内注射评估其对转录和SI的影响；
6. 6.
   分子检测平台：包括质谱免疫测定（MSD）定量HTT蛋白、qRT-PCR和分支DNA（bDNA）技术分析mRNA及前体mRNA、PCR片段分析CAG重复长度动态变化。

慢性ASO治疗降低突变Htt的CAG重复序列体细胞不稳定性并抑制转录速率

通过长期外周给予靶向Htt的ASO，研究发现肝脏中HTT蛋白和mRNA水平显著降低，同时SI明显减弱。转录速率分析显示，ASO处理降低了Htt前体mRNA水平，且该效应沿转录本下游增强，提示ASO可能通过“鱼雷机制”干扰RNA聚合酶进程，间接抑制转录。

Lac阻遏介导的梯度转录抑制减轻SI

利用Htt^LacO-Q140/+模型，研究者发现IPTG撤除导致的mHTT部分转录抑制可剂量依赖性地减少肝脏SI，且抑制时间越长，保护效果越显著。

CRISPR/Cas9切除近端启动子区域保护免受SI影响

通过AAV介导的CRISPR/Cas9系统删除mHTT启动子区域，实现了成年小鼠中mHTT的完全沉默，并伴随SI的大幅降低，进一步证实转录活性与SI的直接关联。

siRNA降低HTT不影响SI

GalNAc偶联的siRNA处理虽显著降低胞质中HTT水平，但未改变转录速率或SI，明确排除HTT蛋白反式作用调控SI的可能性。

野生型HTT缺失不改变SI

Htt^Q111/-小鼠模型中，完全缺失野生型HTT并未影响mHTT的CAG重复序列在肝脏或纹状体中的扩张，再次验证SI的调控独立于HTT蛋白水平。

ZFP介导的转录抑制与CAG结合共同抑制SI

全长ZFP（DBD+KRAB）可降低mHTT转录和HTT1a（外显子1截短变体）水平，并强烈抑制SI。令人意外的是，仅含DNA结合域（DBD-only）的ZFP虽不影响转录或HTT表达，却能显著减少SI，提示CAG重复序列的物理结合可能通过空间位阻机制阻止MutSβ复合物识别CAG环出结构，从而阻断SI启动。

结论与意义

本研究首次系统阐明HTT降低疗法与SI的关联，揭示核内转录活性是调控CAG重复序列稳定性的关键。DNA靶向策略（如ZFP和CRISPR/Cas9）通过直接干预转录或CAG结合，在降低mHTT的同时抑制SI，而胞质作用的siRNA无效。尤其重要的是，DBD-only ZFP的实现为HD及其他CAG重复疾病（如脊髓小脑共济失调SCA系列）提供了新思路：即开发不降低靶蛋白但专攻SI的疗法，避免因必需蛋白缺失带来的副作用。此外，研究还提示ASO可能通过核内机制间接影响转录，拓展了对非编码RNA药物作用模式的认识。这些发现发表于《Nature Communications》，为下一代HD治疗策略的设计提供了关键理论依据和实践方向。