Cambium LBDs（ cambium-specific long-distance signaling molecules）通过调节由磷脂酰肌醇-3,5-二磷酸（PLP）介导的果胶代谢来促进植物的径向生长

《Nature Plants》：Cambium LBDs promote radial growth by regulating PLL-mediated pectin metabolism

细胞分裂素通过CALBD转录因子调控Arabidopsis根系次生生长，主要作用于细胞壁重塑，特别是PECATE LYASE-LIKE（PLL）基因介导的果胶分解过程。CRISPR筛选发现PLL18、19、22、26在细胞壁机械性和化学组成调控中起关键作用，其活性通过降低未甲基酯化半乳糖醛酸的积累增强细胞膨胀。细胞壁硬度测定和免疫荧光分析显示，PLL突变体因细胞壁刚性增加导致生长受限，而CALBD突变体同时影响细胞分裂和生长。该研究揭示了细胞分裂素-CALBD-PLL信号轴在次生生长中的核心机制，并证实细胞壁代谢与机械特性对植物生长的调控作用。

　　植物的生长依赖于细胞分裂和细胞扩展之间的协调作用。在根部次生组织的径向生长过程中，双面形成层干细胞通过生长和分裂产生木质部和韧皮部的前体细胞，随后这些细胞会根据各自的分化过程发生扩展。在拟南芥根部，细胞分裂素和四个下游的LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN（LBD）转录因子是促进径向生长的关键参与者，尽管其背后的机制仍不清楚。我们的研究结果表明，这些LBD基因主要调节细胞扩展，而不是细胞分裂。通过大规模的CRISPR–Cas9辅助的反向遗传筛选，我们发现一组PECTATE LYASE-LIKE（PLL）基因在细胞分裂素和LBD的调控下，参与调控根部次生组织的径向生长。我们展示了至少一个这些PLL基因，PLL18，具有pectate lyase活性。根据这种活性，PLLs和LBDs通过改变初级细胞壁的果胶组成和机械特性来促进径向生长。我们的发现将细胞分裂素在径向生长中的核心作用与细胞壁重塑联系起来，并为进一步研究激素介导的植物生长调控和细胞壁代谢提供了新的方向。

植物的生长源于细胞的生长（即细胞体积的增加）和分裂。与动物细胞不同，植物细胞被强而可扩展的初级细胞壁包围，这些细胞壁富含多糖，如纤维素、半纤维素和果胶。为了协调细胞分裂和细胞生长，需要对细胞壁代谢进行精细的调控。细胞壁松弛剂被认为通过促进细胞壁应力的放松，从而调节细胞生长，这种机制导致细胞膨压的减少，进而引发水分的吸收和细胞的增大，最终恢复膨压和细胞壁应力。目前最被研究的细胞壁松弛剂是expansins，它们被认为通过非酶促的方式破坏细胞壁中的纤维素的非共价结合来促进细胞增大。早期关于expansins的研究主要依赖于过表达分析和体外活性研究，而它们在各种发育背景中的生物学重要性才刚刚开始显现。另一种潜在的细胞壁松弛剂是木葡聚糖内转糖基酶/水解酶（XTHs）。XTHs切割并连接木葡聚糖，这是连接纤维素微纤丝的主要半纤维素形式。纤维素和半纤维素被包裹在果胶构成的凝胶状基质中，果胶在细胞壁结构中起着重要作用，通过影响细胞壁的组装、机械性能和生长。此外，细胞壁果胶不仅作为结构成分，还作为细胞壁完整性信号中的信号分子。因此，果胶代谢相关因子，如聚半乳糖醛酸酶、pectate lyases、果胶甲酯酶（PMEs）和PME抑制剂（PMEIs），广泛参与植物生长和发育的调控，包括维管组织的发育，因此代表了另一种类型的细胞壁松弛剂。然而，由于这些潜在的细胞壁松弛剂通常在植物基因组中高度冗余，它们在调控细胞生长中的作用仅在少数家族成员中被鉴定。因此，需要对它们在细胞生长调控中的功能进行全面系统地研究。

在拟南芥根部的次生组织中，由双面形成层干细胞介导的径向生长涉及两个主要过程：首先，形成层细胞在径向方向上的生长与周皮细胞分裂相结合，产生具有木质部和韧皮部身份的子细胞；其次，与分化相关的细胞扩展，特别是韧皮部薄壁细胞和木质部导管细胞，提供了进一步的径向生长。我们之前的研究发现，四个植物特异性的LBD转录因子，LBD1、LBD3、LBD4和LBD11（称为CAMBIUM LBDs（CALBDs）），在细胞分裂素信号的下游调控了血管细胞的增殖和细胞生长。在这里，我们进一步探索了CALBDs在调控拟南芥根部径向生长中的分子靶标。通过转录组分析和大规模的CRISPR–Cas9辅助的反向遗传筛选，我们识别出一组编码PECTATE LYASE-LIKE（PLL）蛋白的基因，这些基因在细胞分裂素和CALBDs的调控下，参与调控根部次生组织的细胞和器官水平的径向生长。我们的结果表明，CALBDs和PLLs可能通过调节初级细胞壁的组成来促进径向生长。这些发现突显了初级细胞壁的动态和复杂性，以及其在次生组织径向生长中的影响。

进一步的分析表明，CALBDs主要通过调控细胞壁相关基因和代谢过程来促进径向生长。通过大规模的CRISPR–Cas9辅助的反向遗传筛选，我们发现了一组PLL基因，它们在细胞分裂素和CALBDs的调控下，参与调控拟南芥根部的径向生长。与calbd突变体相比，这些PLL突变体的根部次生生长缺陷较轻，表明PLLs在调控径向生长中起着重要的作用。我们还观察到，PLLs的缺失导致形成层干细胞在根部次生组织中频繁分化，这与calbd突变体的表型相似，进一步支持了PLL介导的果胶代谢在形成层干细胞维持中的关键作用。然而，PLL突变体的表型较轻，这可能意味着CALBDs通过调控多个细胞壁相关因子来实现对细胞生长和增殖的调控。因此，我们的研究结果表明，CALBDs和PLLs共同作用，调控根部次生组织的细胞壁重塑，从而影响径向生长。

此外，我们还发现，细胞分裂素通过CALBDs调控PLLs的表达，从而促进根部次生生长。通过双荧光素酶瞬时表达实验，我们验证了细胞分裂素对PLL18、PLL19和PLL26的调控作用。在calbd突变体中，这些PLLs的表达水平显著低于野生型背景，表明细胞分裂素主要通过CALBDs来调控这些PLLs的表达。同时，PLLs的缺失也导致了根部次生生长的缺陷，但其表型与calbd突变体相比更为轻微，这可能意味着PLLs在细胞分裂素介导的根部次生生长中起着次要作用，而CALBDs是主要调控因子。这些发现表明，细胞分裂素、CALBDs和PLLs之间存在一个调控模块，共同作用于根部次生生长的调控。

在细胞壁的化学和机械特性方面，我们发现CALBDs和PLLs对初级细胞壁的多糖组成和机械性能有显著影响。通过细胞壁单糖组成分析，我们观察到PLL19、PLL22和PLL26以及calbd突变体在根部次生组织中的单糖组成变化相似，而LBD11的过表达则呈现出相反的模式。这些变化表明，CALBDs和PLLs主要通过调控果胶代谢来影响细胞壁的特性。由于果胶甲酯化程度与细胞壁的硬度有关，我们推测，这些变化可能与细胞壁硬度的改变有关。例如，在生长的花粉管的半球形顶端，去甲酯化的果胶与更硬的细胞壁结构和细胞壁扩展的停止相关。通过原子力显微镜（AFM）分析，我们发现calbd和pll突变体的细胞壁比野生型更硬，而LBD11的过表达则导致细胞壁变软。这些结果表明，CALBDs和PLLs通过调控果胶的甲酯化水平，进而影响细胞壁的硬度和弹性，从而调控根部次生组织的生长。

此外，我们还验证了PLL18的pectate lyase活性。尽管初始尝试未能在大肠杆菌中表达PLL19、PLL22和PLL26，但通过合成优化的基因序列，我们成功表达了PLL18，并通过商业试剂盒验证了其pectate lyase活性。这表明PLL18在拟南芥中可能具有功能性的pectate lyase活性。这些发现为理解植物生长调控中的激素信号和细胞壁代谢之间的关系提供了新的视角。

综上所述，我们的研究揭示了细胞分裂素、CALBDs和PLLs在调控拟南芥根部次生生长中的作用。细胞分裂素通过激活CALBDs来调控PLLs的表达，而PLLs则通过改变果胶的组成和机械性能来促进细胞的生长和分化。这些发现不仅深化了我们对植物生长调控机制的理解，还为未来研究激素介导的植物生长调控和细胞壁代谢提供了新的方向。