通过外周输注对CSF1R抑制剂具有抗性的造血细胞来替代小胶质细胞

《Molecular Therapy》：Microglia replacement by peripheral delivery of CSF1R inhibitor-resistant hematopoietic cells

微胶质替换研究新进展：G793A小鼠模型实现高效低毒脑部微胶质再生

　　微胶质细胞替换是研究和治疗神经系统疾病的一种具有前景的方法。研究团队此前通过工程改造一种抗抑制剂的人类CSF1R变体（G793A）实现了高效的微胶质细胞替换。在这项研究中，以及在Chadarevian等人的研究中，我们引入了一种携带相同鼠源抗抑制剂突变（G793A）的转基因小鼠模型。这种突变使得微胶质细胞对CSF1R抑制剂（CSF1Ris）具有抗性，同时不影响细胞或整体功能，从而允许通过血管内给药的方式实现脑内微胶质细胞的替换。G793A巨噬细胞在细胞实验中表现出正常的CSF1R信号传导和效应反应。通过将CSF1Ris治疗与外周血管输送的G793A髓系细胞或祖细胞结合，可以在新生和成年小鼠中实现微胶质细胞的替换，且外周造血细胞的嵌合率较低。通过使用GFP标记的G793A供体细胞进行血管内细胞移植，观察到嵌合率不一致。然而，使用Rag1缺陷型宿主或非免疫原性的同源标记（如CD45.2→CD45.1小鼠）可以实现几乎全部微胶质细胞的替换，表明基于G793A的微胶质细胞替换对宿主适应性免疫功能影响较小。尽管替换效率相同，使用G793A供体进行微胶质细胞替换对神经元和少突胶质细胞前体的毒性低于传统的造血干细胞移植。我们提出了一种更安全、毒性更低的微胶质细胞替换方法，通过静脉输注使用新的研究工具——G793A小鼠。

### 引言

造血干细胞移植（HSCT）在多种神经系统疾病治疗中的成功，促使了对微胶质细胞替换、内源性微胶质细胞清除以及细胞替代策略的研究兴趣不断增加。尽管这是一种有前景的治疗手段和发现工具，但为了提高其在疾病模型研究和治疗应用中的实用性和适用范围，需要开发新的方法来降低毒性并提高特异性和效率。我们最近展示了一种基于组织特异性微胶质细胞替换的新方法，该方法基于CSF1R抑制剂（CSF1Ri）能够暂时清除微胶质细胞的发现，以及在人类CSF1R中发现的一个点突变（G795A）使得细胞对CSF1Ri清除具有抗性。将人源抑制剂抗性受体（IRR）表达细胞与CSF1Ri治疗结合，能够实现有效的微胶质细胞替换。在本研究中，我们验证并应用了G793A小鼠，这是一种经过基因工程改造的转基因小鼠，携带G795A的人类CSF1R的鼠源同源突变。在本研究中，我们重点研究了G793A小鼠及其在CSF1Ri治疗后通过血管内给药实现髓系细胞向脑部输送的特性。与传统的HSCT方法相比，G793A小鼠提供了一种更安全、更特异性的策略，用于研究微胶质细胞的替换。

### 结果

#### G793A CSF1R突变赋予小鼠巨噬细胞对抑制剂的抗性

我们旨在将IRR策略扩展到小鼠的微胶质细胞替换，以促进免疫健全模型中的整体和转化研究。首先，我们测试了G793A突变是否也赋予小鼠巨噬细胞对CSF1R抑制剂的抗性。我们从Chadarevian等人描述的G793A小鼠中生成了G793A骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs），并测试了它们对CSF1R抑制剂（如PLX3397、PLX5622和BLZ945）的抗性。结果显示，G793A突变赋予的抗性是野生型（WT）巨噬细胞的12至46倍，但没有CSF1Ri的情况下，WT和G793A BMDMs的存活和生长依赖于CSF1。此外，G793A-BMDMs在没有CSF1Ri的情况下表现出正常的形态特征。当用CSF1刺激时，WT和G793A-BMDMs均显示Y723和下游靶点ERK的磷酸化，表明正常的CSF1反应性。最后，CSF1Ri在WT-BMDMs中阻止了Y723和ERK的磷酸化，而G793A-BMDMs在至少250 nM PLX3397浓度下仍能保持受体和ERK的磷酸化，这大约是其对WT巨噬细胞的半数抑制浓度（IC50）的24倍。

#### 同源G793A小鼠在生理上正常但具有CSF1Ri抗性的微胶质细胞

G793A小鼠为评估同源抑制剂抗性CSF1R突变对体内生理的影响提供了理想的机会。在两个机构的繁殖群体中，我们发现G793A小鼠的繁殖对和后代均未表现出明显的病理迹象，包括与GFP（The Jackson Laboratory，目录号006567）或mTmG（The Jackson Laboratory，目录号007676）报告线杂交。G793A小鼠的窝数、性别比例、存活率和体重均正常。我们通过提供含PLX3397（PLX，600 mg/kg）的饮食对成年小鼠进行测试，并通过流式细胞术分析脑部巨噬细胞群。如预期，PLX处理的WT-CSF1R动物（WT + PLX）中CD11b+CD45+细胞几乎消失，表明微胶质细胞被成功清除。相比之下，G793A-CSF1R动物（G793A + PLX）中存在丰富的CD11b+CD45+细胞，并且维持了与WT微胶质细胞相当的稳态微胶质细胞标记TMEM119的表达。通过IBA1免疫染色进一步验证了这些结果：G793A小鼠在基线和CSF1Ri治疗后均表现出正常的微胶质细胞密度、排列和形态。

#### G793A巨噬细胞在体外条件培养基中对PLX3397的反应

为了评估G793A突变对体内生理的影响，我们通过提供含PLX3397的饮食对成年小鼠进行测试，并通过流式细胞术分析脑部巨噬细胞。如预期，CD11b+CD45+脑细胞在PLX处理的WT-CSF1R动物中几乎消失，表明微胶质细胞被成功清除。相比之下，G793A-CSF1R动物中存在丰富的CD11b+CD45+细胞，并且维持了与WT微胶质细胞相当的稳态微胶质细胞标记TMEM119的表达。IBA1免疫染色进一步验证了这些结果：G793A小鼠在基线和CSF1Ri治疗后均表现出正常的微胶质细胞密度、排列和形态。

#### G793A髓系细胞在血管内给药后可植入脑部

为了验证G793A巨噬细胞是否能植入CSF1Ri处理后的脑部，我们将G793A单核细胞通过颅内注射方式输送到PLX处理的新生小鼠体内，并发现它们在2周内能够有效地填充脑部并替代95.33% ± 1.14%的内源性微胶质细胞。同样，我们测试了成年小鼠的植入情况，通过立体定位注射。G793A单核细胞和条件性永生化巨噬细胞前体（ER-Hoxb8s）均能植入脑部并替代高达96.90% ± 2.20%的微胶质细胞。这些发现表明，G793A转基因小鼠模型是微胶质细胞替换研究的重要来源，包括通过生成条件性永生化巨噬细胞前体进行的直接研究。这些数据验证了Chadarevian等人报告的直接CNS微胶质细胞替换的广泛研究。

#### G793A髓系细胞在血管内给药后植入成年小鼠脑部

为了确定G793A是否能在不使用传统化疗或全身照射的情况下实现微胶质细胞的替换，我们将G793A供体细胞通过眶后静脉注射输送到成年小鼠体内，并配以PLX或PLX/Busulfan治疗，通过标准方法量化微胶质细胞的替换情况。G793A- exHSPCs植入并占据39.39% ± 10.40%的脑部区域，具有树突状形态，而WT供体细胞未植入。然而，G793A的植入情况相较于Busulfan处理的髓系细胞移植表现出明显的变异，这在组织学和流式细胞术中有所体现。尽管植入的细胞仍然表达GFP和TMEM119，但Busulfan处理的动物中，GFP在脾、血液和骨髓中的嵌合率较低。在肝脏中，Busulfan和G793A + PLX组的植入情况相似。值得注意的是，G793A供体细胞在没有PLX治疗的情况下无法植入脾和肝脏。这些数据表明，CSF1Ri与血管内输注CSF1Ri抗性细胞结合，能够实现对脑部巨噬细胞的特异性替换，相较于全身性髓系细胞移植（myeloablative HSCT）具有更高的组织特异性。

#### 外周微胶质细胞替换的变异性和GFP转基因表达的丧失

尽管G793A- exHSPCs在血管内给药后表现出较高的脑部嵌合率，但我们在成年小鼠中观察到显著的植入变异。在某些动物中，GFP阴性细胞表现出显著的植入，甚至在某些情况下占据主导地位。这种变异现象在之前的实验中已被观察到，这表明GFP阴性细胞可能是供体来源的，尤其是在G793A + PLX组中。在其他研究中，PLX处理的小鼠通常表现出微胶质细胞的广泛清除，这同样适用于所有未移植的同窝对照（例如，图3B和图S3B）。这引发了我们对GFP阴性细胞是否为供体来源的怀疑，尤其是因为GFP阳性细胞和GFP阴性细胞均普遍表达Ms4a7这一BM来源的标记，而不表达内源性微胶质细胞。此外，它们的形态相似。在G793A + PLX组中，包括GFP阴性巨噬细胞在内的植入测量显著增加了显性嵌合率，而在Busulfan组中，这种情况并未发生。为了验证这些结果，我们还测试了GFP阳性单核细胞的静脉移植。确实，G793A单核细胞能够植入PLX处理的脑实质，但同样表现出GFP阳性细胞和CD11b+CD45+细胞在脑部中的数量差异。在某些动物中，当比较GFP阳性细胞的频率与总CD11b+CD45+细胞群时，嵌合率从约4%增加到约95%。然而，在某些动物中，即使包括GFP阴性巨噬细胞，我们也没有发现显著的植入率。这种植入变异，包括某些动物完全缺乏供体嵌合率，是血细胞移植排斥现象中常见的。

#### 宿主免疫缺陷或免疫沉默的供体细胞完全恢复移植变异

GFP表位在主要组织相容性（MHC）复合物上呈现可能引发移植排斥。我们发现GFP的丧失也与髓系细胞和移植模型有关。因此，我们推测IRR基于的移植，与传统的髓系细胞移植不同，可能保留宿主适应性免疫功能，导致GFP细胞的排斥或选择具有低/无表达的供体细胞。为了验证这一假设，我们将GFP阳性G793A- exHSPCs移植到缺乏成熟B和T细胞的Rag1 KO宿主中。这完全恢复了变异并显著提高了植入率。在G793A- exHSPC + PLX → Rag1 KO移植中，90%的CD11b细胞为GFP阳性，这与G793A- exHSPC + Busulfan移植中的87%相似或略有增加。由于Rag1的缺失可能导致髓系细胞植入的其他影响，我们进一步使用“免疫沉默”供体标记策略，将CD45.2;G793A- exHSPCs移植到免疫健全的CD45.1受体小鼠中，并使用同型特异性抗体区分供体细胞。这种移植策略显著提高了植入率，并在一定程度上恢复了Rag1缺失对移植变异的影响，包括使用单核细胞供体。

#### 使用PLX3397进行G793A移植减少神经毒性

传统的髓系细胞移植需要使用高剂量化疗或全身照射，这会导致神经毒性，包括神经前体细胞和少突胶质细胞前体（OPCs）的几乎完全丧失。我们直接比较了IRR-CSF1Ri和PLX + Busulfan移植对齿状回神经前体和OPCs数量的影响。与Busulfan HSCT相比，IRR-CSF1Ri方法显著减少了这些毒性。在微胶质细胞替换期间接受PLX3397饮食的动物，其DCX+神经前体和PDGFRα+ OPCs的损失显著减少，并在CSF1Ri停止14天后完全恢复正常。这些数据表明，尽管传统的HSCT会导致广泛的再生神经细胞破坏，但G793A与CSF1Ri治疗结合可以减少这些毒性，而不会影响替换效率。

### 讨论

传统的微胶质细胞替换策略，借鉴自传统的HSCT，有两个相互依赖的要求：（1）使用照射或化疗进行预处理以创造一个适宜的微环境，（2）输注HSCs以重建被清除的区域，防止造血失败并生成脑部植入的髓系细胞。脑部照射和化疗与严重的认知障碍和全身毒性密切相关，但关键研究表明，通过头部屏蔽或使用更温和的化疗减少预处理强度会阻碍微胶质细胞的替换。一项关键研究显示，髓系细胞的清除通过诱导微胶质细胞衰老，导致再生潜力的丧失和自我更新的受损。然而，预处理的其他后果，如神经前体细胞损伤和损伤诱导的趋化因子产生，是否对植入是必要的仍不清楚。之前的研究表明，CSF1R抑制剂与髓系细胞清除结合可以增强微胶质细胞的替换，而遗传性微胶质细胞的缺失允许来自循环前体的广泛植入。这些发现表明，微胶质细胞的丧失本身可能足以作为预处理，尽管在CSF1Ri停止后或遗传性缺失后，居民细胞的快速反弹突出了它们的竞争优势。

我们的研究通过一种具有转化潜力的方法验证并澄清了这些前提条件，提供了直接证据表明暂时的微胶质细胞清除会引发髓系细胞的流入、植入和广泛的微胶质细胞替换。使用CSF1R G793A变体，我们实现了无需传统预处理或头部照射的脑部广泛植入，包括使用造血前体细胞和终末分化的单核细胞。重要的是，G793A工程化供体细胞能够植入并扩展，同时避免现有方法的神经毒性。我们未发现该免疫受体的工程化会导致肿瘤形成或改变免疫功能，即使在全局表达的情况下，这对于后续的治疗应用是一个重要的考虑因素。

在这些方面，G793A方法修订了微胶质细胞替换的基本前提，并突出了几个新的研究方向。通过仅使用小分子抑制剂实现微胶质细胞的替换，而无需传统化疗或照射，需要重新考虑“脱靶”效应，将其纳入组织植入和受体酪氨酸激酶抑制的特异性框架。与传统的HSCT不同，G793A方法具有相对较高的脑部嵌合率和较低的外周植入率。同时，它并非完全特异性，因为我们观察到显著的肝脏植入，这与传统的HSCT相当。未来的研究需要更好地理解供体细胞的组织进入机制，并结合细胞工程，以调节不同器官的替换水平，从而提供一个灵活的平台用于巨噬细胞定向治疗，并有机会在减少全身毒性的情况下递送疾病修饰负载。尽管PLX3397是一种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的CSF1Ri，具有广泛的其他III型受体酪氨酸激酶活性，但潜在的优化抑制剂，可能与新的CSF1R变体结合，可以进一步减少毒性，同时提高效率和/或组织特异性。这些改进对于快速进展的白质营养不良症尤为重要，因为HSCT已经在临床使用，而安全边际有限。

另一个创新方向更广泛地涉及提高精确免疫治疗的效率。G793A;GFP供体细胞表现出植入变异和GFP转基因表达的丧失，这些现象在使用免疫沉默的供体标记或免疫缺陷宿主时被恢复。这可能是由于在非髓系细胞清除条件下，适应性免疫的保留导致了对抗原性供体细胞的选择压力，进而促进了那些抑制了抗原性转基因的供体细胞群体的扩展。对供体细胞抗原的体液和细胞毒性反应的免疫表型分析将有助于澄清这一可能性。这一观察结果与在头部特异性照射后供体细胞的排斥一致，这种照射也能独立于全身性髓系细胞清除实现植入。尽管这些结果与在耐受和原位肿瘤模型中的观察一致，但我们也对以下现象感到好奇：尽管有强烈证据表明宿主适应性免疫抑制了供体GFP表达，但某些宿主能容忍大量的转基因表达，而其他宿主则几乎没有。在之前对单核细胞浸润的研究中，观察到脑部植入的巨噬细胞具有较高的克隆性，这可能与供体细胞中GFP反应性初始T细胞的低丰度有关，这可能导致在移植后GFP表达的显著变化。此外，系统性CSF1R抑制，无论是由于靶向还是脱靶效应，可能增加GFP排斥的阈值，从而导致GFP丰度的变异。

我们还注意到，在将exHSPCs移植到免疫缺陷小鼠后，脾、血液和骨髓中的外周嵌合率呈上升趋势，并且肝脏植入显著增加。这一发现可能反映了GFP的沉默或适应性免疫发育、骨髓稳态和外周细胞植入之间的有趣反馈，这值得进一步研究。随着更先进的细胞输送和植入方法的发展，将潜在抗原负载和细胞递送到免疫健全宿主中的挑战突显了对机制洞察和新策略以促进耐受性的需求。

G793A模型还有潜力增强对微胶质细胞生物学的基本研究。一个特别有前景的应用是直接测试对任何基因（或基因组）的靶向突变如何影响微胶质细胞功能，包括大规模的体内筛选。为了支持这些努力，我们展示了G793A小鼠作为移植的可再生供体细胞来源，包括ER-Hoxb8巨噬细胞和exHSPCs。尽管临床HSCT不使用扩展的HSCs，但体外HSPC扩展允许进行严格控制的基于HSCT的CRISPR筛选，并移植克隆性衍生的工程化exHSPCs，这对筛查和最小化细胞工程的脱靶影响具有极大的吸引力。这些方法和我们对体外细胞输送的测试补充了Chadarevian等人在本期的研究，他们应用CSF移植来替换宿主的真正胚胎系微胶质细胞，并展示了G793A小鼠作为识别CSF1Ri PLX3397对免疫系体内脱靶效应的强大工具。

总体而言，我们的研究结果表明，暂时清除居民微胶质细胞，结合CSF1R工程化，足以实现无毒预处理的持久植入。这项工作重新定义了微胶质细胞替换的前提条件，并建立了更安全、更精确和可调节的细胞治疗平台。通过直接解决毒性、特异性以及免疫原性问题，这种策略为神经系统的疾病治疗开辟了一条具有深远影响和更广泛临床应用的路径。