工作记忆相关多脑区序列放电的层级式回放机制解析

《Neuroscience Bulletin》：Hierarchical Replay of Multi-regional Sequential Spiking Associated with Working Memory

本刊推荐：为揭示毫秒级神经活动如何介导秒级行为，研究人员利用Neuropixels探针记录了小鼠执行嗅觉工作记忆(WM)任务的全脑神经元放电活动。研究发现，记忆编码神经元间存在毫秒级跨区域放电耦合(SC)，这些耦合构成链式、单环及嵌套环状活动模体，并在任务前后及试次间隔期(ITI)出现回放。模体呈现层级组织特性（时间常数与参与神经元数量递增），为感知工作记忆的维持提供了潜在机制。

　　

大脑如何在不同的时间尺度上运作，从快速的毫秒级神经元放电到持续数秒的行为，如工作记忆(Working Memory, WM)，是系统神经科学的核心问题之一。工作记忆涉及对外部及内部信息的主动保持，其神经基础表现为不同脑区在记忆延迟期(Delay period)的持续活动。尽管已有诸多理论试图解释这一过程，例如细胞集群假设(Cell-assembly hypothesis)、吸引子网络理论(Attractor network theory)、同步放电链模型(Synfire chain model)以及群体动态的瞬态轨迹概念，但大多数实验观察局限于局部脑区。随着行为需要多个脑区神经环路的协同工作，理解支持行为的神经元放电的全脑组织原则变得至关重要。一个关键问题是，这些与工作记忆相关的神经活动是仅在记忆保持的需求下被触发，还是会在延迟期之外（例如任务执行前后或试次间隔期）自发地“回放”(Replay)？这种回放现象在睡眠和清醒状态下均有发现，主要在海马体(Hippocampus, HIP)和新皮层，通常与慢波涟漪(Slow-wave ripple)和过去经验的时间压缩有关，可能有助于记忆巩固、工作记忆以及构建内部表征以改善学习与决策。然而，工作记忆相关的放电活动是否以及如何在延迟期外回放，尚不清楚。

近期，Neuropixels探针技术的发展使得能够在行为动物身上同时记录数百个神经元的毫秒级放电活动，为在全脑范围揭示行为的神经关联提供了前所未有的机会。发表在《Neuroscience Bulletin》的这项研究，利用双Neuropixels探针，在小鼠执行嗅觉延迟配对关联(Olfactory Delayed Paired-Association, ODPA)任务时，记录了62个脑区超过33,000个神经元的放电活动，旨在探究毫秒级放电模体是否在全脑范围内以层级方式组织，以支持秒级的工作记忆。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：1. 行为训练：训练成年C57BL/6J雄性小鼠在头固定条件下执行ODPA任务，任务包含样本气味(Sample odor)传递、延迟期（3秒或6秒）、测试气味(Test odor)传递和反应窗口。2. 在体电生理记录：在训练好的小鼠上，通过立体定位手术植入双Neuropixels探针，同步记录多个脑区在任务执行前后及过程中的神经元动作电位。3. spike sorting（峰电位分类）：使用Kilosort2对记录的原始信号进行离线分析，识别并分类单个神经元单元(Single units)。4. 组织学追踪与脑区定位：记录结束后，通过组织学处理（如荧光染料标记探针轨迹、脑片成像）将记录位点注册到艾伦脑图谱(Allen Brain Common Coordinate Framework, CCF)的标准化空间，以精确定位每个神经元的所属脑区。5. 数据分析算法：包括记忆神经元（在延迟期放电率对样本气味有显著差异的神经元）的鉴定、活动波（Activity wave）分析（通过时序调制中心Temporal Center of Modulation, TCOM排序）、 spike coupling (SC, 放电耦合)分析（基于基线校正的交叉相关图Baseline-corrected cross-correlogram, BCCC）、活动链(Activity chains)和活动环(Activity loops)等序列模体的检测、以及回放事件的分析等。

大脑全范围编码工作记忆信息的活动波

研究人员首先鉴定了在延迟期对样本气味信息具有编码能力的“记忆神经元”。这些神经元广泛分布于记录的脑区中，嗅觉相关区域（如TT、AON、PIR）的比例最高。记忆神经元的区域比例与来自嗅觉区域的解剖连接输入强度呈正相关。大多数记忆神经元表现为“瞬态”(Transient)选择性，即仅在延迟期的部分时间窗显示选择性，而非在整个延迟期持续放电（“持续” Sustained神经元）。尽管单个神经元是瞬态的，但通过按TCOM排序记忆神经元，可以揭示出覆盖整个延迟期的群体“活动波”，该活动波在延迟期具有较高的 Trial 间一致性，而在不需要记忆保持的试次间隔期(ITI)则显著减弱，且与行为表现相关。活动波的时序与来自嗅觉和海马区域的解剖输入呈负相关，表明活动波主要从嗅觉和海马区域向其他区域传播。

支撑记忆神经元和活动波的放电耦合

为探究支持秒级活动波的毫秒级动态，研究人员分析了神经元对之间的放电耦合(Spike coupling, SC)。SC指两个神经元在10毫秒时间尺度上的顺序性共激活。研究发现，跨区域SC的强度与脑区间的空间距离呈幂律反比关系。更重要的是，偏好相同WM信息（即“一致” Congruent）的记忆神经元对之间的SC强度，显著高于偏好不同信息（“不一致” Incongruent）的记忆神经元对或非记忆神经元对。利用耦合放电对(Coupled spike pairs, CSP)的频率进行支持向量机(Support Vector Machine, SVM)解码分析，发现一致CSP对样本气味信息具有解码能力，且其在正确试次中的解码能力高于错误试次。此外，记忆神经元间跨区域SC的方向与脑区活动波传播方向（由区域平均TCOM衡量）的一致性程度，显著高于非记忆神经元。

由耦合放电连接的活动链和单环

放电耦合可将神经元连接成更复杂的活动模体。研究人员发现了由SC连接的“活动链”(Activity chains)，类似于同步放电链模型。这些链可由3至9个神经元组成，其方向可与活动波方向一致（“一致链”）或相反（“不一致链”）。一致链的数量显著多于不一致链，且均远高于随机打乱数据的水平。活动链中连续的放电序列持续时间中位数约为11.2毫秒。此外，还发现了 recurrent 的“单环”(Single loops)结构，由3-5个神经元通过SC连接成环状。一致记忆神经元构成的单环出现率也显著高于不一致或非记忆神经元。单环的典型持续时间约为22.0毫秒。约有16.6%的记忆神经元参与了活动链或单环，这些神经元在延迟期内有3.9%的放电与这些模体相关。脑区分析显示，海马、嗅觉皮层和前额叶皮层等区域的神经元更倾向于参与这些模体。

工作记忆相关活动链和环的回放

令人惊讶的是，这些活动模体并不仅限于延迟期内出现。在任务开始前、结束后以及试次间隔期(ITI)这些“延迟期外”时段，也观察到了这些模体的“回放”(Replay)。回放模体的出现频率显著高于随机水平，且由记忆神经元构成的模体的回放频率高于非记忆神经元模体。特别值得注意的是，涉及海马神经元的模体，其回放频率在延迟期外与偏好延迟期内相当，而在非偏好延迟期内则受到抑制，凸显了海马在活动回放中的重要作用。回放活动与行为表现存在微弱关联，在错误试次的ITI中回放略弱。

活动链、单环和嵌套环的层级组织

活动模体可进一步组织成更复杂的“嵌套环”(Nested loops)，即不同的链或环通过共享的神经元连接在一起。嵌套环包含更多的神经元和SC连接，其连续激活的持续时间更长（中位数约12.7毫秒）。嵌套环同样表现出记忆选择性和回放特性。通过系统性移除嵌套环中的特定组件（如SC、活动链、单环或海马神经元），发现不同组件对嵌套环完整性的影响模式不同，海马神经元的移除尤其容易导致嵌套环的缩小或分裂。对不同层级模体（SC、活动链、单环、嵌套环）的激活持续时间分布分析显示，其长尾部分可用幂律函数拟合，且幂律指数随模体层级升高而增加，表明存在时间尺度上的层级组织。通过外推法估计，若同时记录数千个神经元，由这些模体形成的放电序列持续时间可覆盖整个延迟期长度。

本研究通过高密度全脑电生理记录，揭示了工作记忆背后神经活动的一种层级式组织原则：从毫秒级的放电耦合(SC)，到数十毫秒级的活动链和单环，再到更持久的嵌套环，模体的时间常数和参与的神经元数量逐级增加。这些层级组织的活动模体不仅在任务需求下被调制以支持记忆相关的全脑活动波，还会在任务需求之外（任务前后、试次间隔）自发回放，尤其依赖于海马神经元的参与。这种基于序列放电的层级回放机制，为理解大脑如何跨越时间尺度协调神经活动以维持知觉工作记忆提供了新的框架。未来的研究需要通过因果性干预（如光遗传学操控特定节点或连接）来进一步验证这些模体在工作记忆表现中的必要性。此外，这些模体在学习和记忆巩固过程中的动态变化，以及其背后的突触可塑性机制，将是重要的研究方向。