新生儿AAV递送技术实现成年大脑皮层多传感器稳定共表达与双光子成像

《iScience》：Rapid neonatal AAV delivery for adult cortical two-photon imaging of genetically encoded sensors

本研究针对成年小鼠脑内AAV（腺相关病毒）递送存在手术创伤大、技术门槛高及神经炎症反应显著等问题，开发了一种快速、高效的新生儿颅内AAV注射方法。该方法通过冰麻醉和自由手注射，将AAV混合快速绿色染料定向递送至新生鼠皮层，实现了成年后皮层神经元中多达4种AAV载体（如GCaMP6f、tdTomato、DREADD等）的稳定共表达。实验表明，与成年注射相比，新生儿注射将单只动物操作时间缩短40–50倍，显著降低胶质细胞激活（GFAP/Iba1信号减弱），并支持清醒行为动物皮层微环路的长期结构-功能双光子成像。该技术为神经元活动可视化与操纵提供了高通量、低炎症反应的解决方案，对神经环路研究具有重要方法论意义。

　　

在神经科学领域，精准观察和操纵活体大脑中特定神经元的活动是理解神经系统功能的关键。目前，研究者常通过转基因动物或腺相关病毒（AAV）介导的基因递送来表达荧光传感器（如GCaMP6f），以记录神经元钙信号。然而，转基因动物成本高、表达弱；而成年动物脑内AAV注射虽常用，却需开颅手术，易引发神经炎症，且技术门槛高、耗时长。能否找到一种更高效、创伤更小的方法，实现多传感器在皮层神经元的稳定共表达？这成为领域内亟待突破的难题。

针对上述问题，Wisser等人在《iScience》上发表研究，开发了一种新生儿AAV颅内注射技术。该方法通过在出生后0–3天（P0–P3）将AAV与快速绿色染料混合，经冰麻醉后自由手注射至小鼠皮层，实现了成年后皮层神经元的高效标记。相比成年注射，该技术将单只动物操作时间从35–45分钟缩短至约47秒，注射通量提升40–50倍，且成年后动物无明显手术疤痕，神经炎症反应显著降低。

研究主要采用以下关键技术：

1. 1.
   新生儿AAV注射：通过冰麻醉诱导新生鼠 immobility，在立体显微镜下根据颅骨标志（如bregma、矢状窦）进行皮层定向注射，注射成功率通过染料扩散形态（皮下/皮层/脑室内）实时判断。
2. 2.
   多AAV共表达策略：使用AAV9血清型载体，混合Cre依赖性传感器（如Flex-GCaMP6f、Flex-tdTomato）与启动子特异性AAV（如CaMKII-Cre、hSYN），通过调节病毒比例实现稀疏至密集的神经元标记。
3. 3.
   清醒动物双光子成像：在成年鼠（P30–P190）头部固定窗口模型下，采用双光子显微镜记录皮层L2/3至L5神经元在静息或行为任务（如跑步机、虚拟现实T迷宫）中的钙活动，并结合化学遗传学（DREADD-hM3Dq）调控神经元活动。
4. 4.
   免疫组化与图像分析：通过GFAP/Iba1免疫荧光染色量化神经炎症，并利用Pearson相关性分析多色荧光共表达效率。

新生儿AAV注射显著提升操作效率并降低炎症

研究显示，新手实验员经5次尝试即可掌握注射技术，且注射时间与窝仔数呈弱相关（r=0.60）。成年后，新生儿注射侧皮层硬脑膜更薄，双光子成像深度更深（r=0.90）。

对比同一动物双侧半球（新生儿注射vs.成年注射）发现，成年注射侧GFAP与Iba1信号强度显著升高（ART ANOVA: p<0.001），表明新生儿注射有效缓解了AAV引发的胶质细胞激活。

多AAV共表达支持神经元类型特异性成像

在CaMKII-Cre、PV-Cre、SST-Cre等转基因鼠中，新生儿注射的AAV可实现GCaMP6f在锥体神经元与GABA能中间神经元中的稳定表达。

通过调节AAV-Cre浓度，可精确控制标记密度，实现单神经元形态（如树突棘）与功能（钙瞬变）的同时记录。例如，在L5锥体神经元中，跑步行为可诱发树突与胞体钙信号的解耦或同步活动。

四重AAV共表达验证技术复用性

共注射AAV9-CaMKII-Cre与三种Cre依赖性荧光蛋白（tdTomato、eGFP、BFP）后，在成年鼠前额叶皮层同一成像平面内，38个神经元显示高强度共表达（eGFP与BFP Pearson r=0.97）。

这表明该技术适用于多基因工具的高效导入。

长期成像揭示行为相关神经编码

在后顶叶皮层（PPC）注射AAV9-hSYN-jGCaMP8f与AAV9-mDlx-NLS-mRuby2后，84%的动物在成年期（P167–P194）保持稳定传感器表达。

在虚拟现实T迷宫任务中，Layer 2/3神经元表现出与决策、奖励相关的时间特异性钙活动，且匹配神经元在不同会话间活动模式高度保守。

本研究通过新生儿AAV递送技术，成功解决了成年脑内AAV注射的创伤大、炎症强、操作复杂等瓶颈。该技术不仅支持多达4种AAV在皮层神经元的稳定共表达，还实现了清醒动物长期、深层的双光子成像，为神经微环路的结构-功能研究提供了高通量平台。未来，通过结合立体定位框架或优化病毒组合，该策略有望进一步拓展至皮下脑区精准靶向。总之，这项工作为神经科学家提供了一种高效、可扩展的基因工具递送新范式，对推动体内神经环路的动态解析具有里程碑意义。