PmMAD7基因编辑系统的开发与验证：提升斑节对虾基因编辑效率与精准性的新工具

《BMC Biotechnology》：Development and validation of PmMAD7 for efficient gene editing in Penaeus monodon

本研究针对传统CRISPR-Cas系统在斑节对虾中存在的脱靶效应高、PAM序列要求严格等问题，开发了特异性优化的PmMAD7基因编辑系统。研究人员通过密码子优化和核定位信号修饰，实现了对ECH1和AQP4基因的高效敲除，编辑效率分别达到14.81%和20.57%，显著优于LbCas12a系统。该研究首次在甲壳动物中成功应用MAD7核酸酶，为水产养殖物种的遗传改良提供了新的技术平台。

　　

在当今水产养殖业快速发展的背景下，斑节对虾作为全球高价值养殖物种，其遗传改良却受到疾病易感性和环境胁迫耐受性有限的制约。基因编辑技术特别是CRISPR-Cas系统，为水产养殖物种的遗传改良带来了新的希望，能够显著提升经济物种的生长速度、抗病能力和环境适应性。然而，传统CRISPR-Cas9系统在甲壳动物特别是斑节对虾中的应用面临着巨大挑战：高度复杂的基因组结构、显著的脱靶效应以及严格的PAM序列要求，这些都限制了该技术在水产养殖中的广泛应用。

面对这些技术瓶颈，Huang等人开展了一项创新性研究，开发了专门针对斑节对虾优化的PmMAD7基因编辑系统。MAD7作为Inscripta公司商业化的Cas12a家族新成员，相比传统Cas9系统具有明显优势：更宽松的PAM序列要求、更低的脱靶效应以及产生粘性末端的切割特性。研究团队通过密码子优化、核定位信号添加以及mRNA化学修饰等策略，显著提升了该系统在斑节对虾细胞中的表达效率和编辑精度。

关键技术方法包括：从华南农业大学深圳实验基地获取斑节对虾样本，通过血淋巴细胞分离培养建立实验体系；利用AlphaFold和SWISS-MODEL进行蛋白结构分析；采用密码子优化和核定位信号修饰构建PmMAD7系统；通过纳米脂质体转染技术将crRNA和PmMAD7 mRNA导入血淋巴细胞；使用下一代测序验证编辑效率；通过qPCR和表型分析评估基因功能。

Structural analysis of MAD7

研究人员首先对MAD7核酸酶进行了结构分析，发现其与LbCas12a虽然同属Cas12a家族，但存在显著差异。MAD7由1287个氨基酸组成，比LbCas12a略大，但比常用的SpCas9更小。通过AlphaFold和SWISS-MODEL的预测模型显示，MAD7具有典型的双叶结构，包含REC叶和Nuc叶，这种结构对其核酸酶活性至关重要。与Cas9不同，MAD7缺乏HNH结构域，其切割机制依赖于RuvC、PI和WED结构域的特殊配置。

Construction and optimization of the MAD7 system

研究团队对MAD7系统进行了多项优化：首先添加了来自SV40和核质蛋白的核定位信号序列，随后进行了密码子优化以适应斑节对虾的翻译机制。优化后的PmMAD7构建体由CMV启动子驱动，并通过体外转录合成mRNA。为提高mRNA稳定性，研究人员在转录过程中使用了共转录类似物，在5'端生成Cap1结构，在3'端添加了包含100个腺嘌呤的poly(A)尾。这些优化措施显著提升了PmMAD7在斑节对虾细胞中的表达效率。

Transfection of hemocytes and verification of gene editing in P.monodon

通过纳米脂质体介导的crRNA和PmMAD7 mRNA递送，研究人员成功实现了对ECH1和AQP4基因的靶向编辑。桑格测序结果显示靶位点附近出现双峰，表明存在杂合突变。下一代测序进一步证实了靶位点的单核苷酸多态性和插入/缺失突变，其中ECH1的敲除效率为14.81%，AQP4为20.57%，显著高于LbCas12a的编辑效率。

Phenotypic analysis and evaluation posttargeting of the ECH1 and AQP4 genes

基因敲除后的表型分析揭示了ECH1和AQP4基因的重要功能。ECH1敲除导致细胞体积增大，平均直径从12.74μm增加到17.88μm，同时细胞死亡率显著升高至85.33%。相反，AQP4敲除引起细胞体积减小至9.28μm，存活率降至25.33%。qPCR分析显示，ECH1和AQP4的表达水平分别降低了81.5%和78.33%，证实了PmMAD7系统的有效性和特异性。

讨论部分深入分析了PmMAD7系统的优势及其在甲壳动物基因编辑中的重要意义。相比传统Cas9系统，MAD7具有更宽松的PAM序列要求，能够识别YTTN序列，这在AT含量较高的斑节对虾基因组中尤为重要。密码子优化和核定位信号的添加显著提升了编辑效率，而mRNA转染方法的优化进一步增强了系统的稳定性。血淋巴细胞作为实验平台的优势在于其易获得性和分子响应性，为基因编辑验证提供了可靠体系。

ECH1和AQP4基因的功能分析为理解甲壳动物代谢和渗透调节机制提供了重要线索。ECH1作为脂肪酸β氧化途径的关键酶，其缺失导致脂质代谢紊乱和细胞体积增大；而AQP4作为水通道蛋白，在维持细胞水平衡中发挥关键作用。这些发现不仅证实了PmAD7系统的有效性，也为后续研究提供了重要的生物学见解。

该研究的创新性在于首次在甲壳动物中成功应用MAD7核酸酶，建立了适用于斑节对虾的高效基因编辑平台。PmMAD7系统相比传统Cas12a表现出更高的编辑效率和更广泛的PAM兼容性，为水产养殖物种的遗传改良提供了新的技术手段。更重要的是，该研究采用的无质粒mRNA-crRNA核糖核蛋白递送方法具有良好的可扩展性，可用于其他组织类型和早期胚胎的基因编辑，为精准育种和可持续水产养殖发展奠定了坚实基础。

这项发表于《BMC Biotechnology》的研究不仅解决了斑节对虾基因编辑的技术难题，更为甲壳动物功能基因组学研究提供了重要工具，对推动水产养殖业的可持续发展具有深远意义。随着技术的进一步优化和应用范围的扩大，PmMAD7系统有望在疾病抗性育种、环境适应性改良等领域发挥重要作用，为全球水产养殖业的发展注入新的活力。