人iPSC分化为皮层神经元过程中的细胞能量代谢重塑：多组学与功能分析揭示早期神经发育关键窗口

《Molecular Neurobiology》：Development of Cellular Energy Metabolism During Differentiation of Human iPSCs into Cortical Neurons

本研究针对神经元分化过程中代谢重编程机制不清的问题，通过NGN2诱导人iPSC分化为皮层神经元模型，整合蛋白质组学、高分辨率呼吸测量术、FLIM和13C6-葡萄糖代谢流分析，发现分化第一周是线粒体生物发生、氧化磷酸化（OXPHOS）增强和磷酸戊糖途径（PPP）重构的关键期，确立了该模型在神经发育疾病研究中的重要价值。

　　

当我们思考大脑如何形成其惊人的复杂性时，一个常被忽视但至关重要的问题是：神经元在发育过程中是如何获得并调整其能量供应系统的？神经元分化不仅仅是形态和功能的转变，更伴随着深刻的代谢重编程。这种从糖酵解为主向氧化磷酸化（OXPHOS）为主的能量代谢模式的切换，对于满足神经元日益增长的能量需求、维持氧化还原平衡以及支持突触发生和轴突生长至关重要。然而，这一关键转变的动态过程、时间窗口及其调控机制在人类神经发育早期仍不甚清晰。许多神经发育障碍，如 Leigh 综合征、MELAS（线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和卒中样发作）综合征等，都与线粒体功能缺陷和能量代谢紊乱密切相关。因此，精确描绘健康神经元发育过程中的代谢轨迹，是理解疾病机制的前提。

为了解决这一问题，研究人员利用了一种高效且可重复的模型系统：通过多西环素（doxycycline, dox）诱导神经源素-2（neurogenin-2, NGN2）过表达，将人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）快速分化为兴奋性皮层神经元。这种NGN2诱导的神经元（NGN2-induced neurons, iNs）能在两周内表达成熟神经元标志物，并表现出功能性特征，为研究早期人类神经发育提供了均质的细胞模型。本研究旨在对这一模型系统在分化早期（第0天iPSCs，第7天iNs_D7，第14天iNs_D14）的代谢重塑进行多维度、功能性的综合表征。

为开展研究，作者团队运用了多项关键技术。细胞模型为NGN2-iPSC来源的皮层神经元。分析手段包括：基因表达分析（RT-qPCR）、无标记定量蛋白质组学（Label-free quantitative mass spectrometry, LFQ-MS）、高分辨率呼吸测量术（Oxygraph-2k系统）评估线粒体功能、荧光寿命成像显微镜（Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）分析NAD(P)H代谢状态、以及基于13C6-葡萄糖的代谢流分析（metabolic flux analysis）追踪葡萄糖利用命运。

建立和表征体外皮层神经元模型

研究人员成功建立了NGN2介导的人iPSC向皮层神经元分化的体系。形态学观察显示，iPSCs从紧凑的克隆转变为具有明显神经突起的神经元形态。分子水平上，RT-qPCR证实多能性标志物（如NANOG, OCT4, REX1, SOX2）表达显著下降，而早期和成熟神经元标志物（如DCX, RBFOX3, SYP, TUBB3, MAP2）表达上调，验证了分化的有效性。

向神经元表型的转变涉及氧化代谢和线粒体生物发生的激活

蛋白质组学分析揭示了分化过程中广泛的蛋白质组重塑。热图和聚类分析显示iPSCs与神经元群体（iNs_D7和iNs_D14）的蛋白表达谱明显分离。差异表达蛋白分析表明，最显著的蛋白变化发生在分化第一周。基因集富集分析（GSEA）显示，在神经元中，与神经元发育（如轴突发生、突触功能）和氧化磷酸化（KEGG OXPHOS）相关的通路显著上调，而与RNA加工和核糖体生物发生等增殖相关的通路下调。同时，甘油磷脂代谢在iNs_D14相较于iNs_D7显著上调，反映了神经元成熟过程中的膜重塑。这些数据表明，分化第一周是代谢重编程的关键时期，伴随着多能性特征的丧失、神经元身份的获得以及线粒体氧化代谢的激活。

线粒体呼吸能力在神经元分化过程中增加

功能研究通过高分辨率呼吸测量术证实了蛋白质组学的发现。虽然常规呼吸（routine respiration）在iNs_D14比iNs_D7有所增加，但最显著的差异在于电子传递系统（electron transport system, ETS）的最大呼吸容量，其在iNs_D7和iNs_D14均显著高于iPSCs。计算得到的呼吸储备容量（respiratory reserve capacity）在iNs_D7比iPSCs高出约三倍，并在iNs_D14保持较高水平，表明分化神经元拥有强大的、未被充分利用的呼吸潜力。蛋白质印迹（Western blot）分析显示，OXPHOS复合体亚基（如ATP5F1B）的丰度在神经元中增加，但当标准化为线粒体含量标志物柠檬酸合酶（citrate synthase, CS）时，其相对丰度无显著变化，说明OXPHOS蛋白的上调与整体线粒体生物发生是成比例的。

神经元分化过程中逐步向氧化磷酸化代谢转变

FLIM对NAD(P)H荧光寿命的分析为单细胞水平的代谢状态提供了证据。NAD(P)H的自由形式寿命短，酶结合形式寿命长，其比例（自由/结合）和强度加权寿命（Tau）可反映代谢状态。研究发现，从iPSCs到iNs_D8，再到iNs_D14-16，NAD(P)H的自由/结合比值显著下降，而Tau值逐渐增加。这表明分化过程中酶结合的NAD(P)H比例增加，代谢向更依赖OXPHOS的方向进行性转变，与呼吸测量数据一致。

分化过程中的代谢重排反映了葡萄糖利用方式的改变

13C6-葡萄糖示踪实验揭示了葡萄糖代谢流的深刻重排。与iPSCs相比，iNs_D14神经元细胞内完全标记的葡萄糖（M+6）和葡萄糖衍生的乳酸（M+3）积累速度更慢，且葡萄糖碳原子掺入三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle, TCA cycle）中间产物（如柠檬酸M+2、琥珀酸M+2、富马酸M+2）的比例降低，提示神经元对葡萄糖氧化的依赖性下降，可能更多利用其他底物（如脂肪酸、谷氨酰胺）支持呼吸。值得注意的是，磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway, PPP）中间产物核糖-5-磷酸（Rib5P）的标记模式在神经元中发生改变，M+3型异构体在360分钟时增加。蛋白质组学数据显示，氧化型PPP（oxidative PPP, oxPPP）的限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）等表达上调，而非氧化型PPP（non-oxidative PPP）酶类表达下调，表明PPP通量向氧化分支倾斜，有利于NADPH的产生。与此一致，葡萄糖衍生的谷胱甘肽（GSH）的M+2标记在神经元中显著增加，结合蛋白质组学中抗氧化通路富集，表明分化神经元增强了其抗氧化防御能力。

研究结论与意义

本研究通过整合多组学和功能分析，详细描绘了人iPSC来源皮层神经元早期分化过程中的动态代谢重塑。研究结果表明，分化第一周是代谢专业化的关键窗口，其特征是线粒体生物发生和OXPHOS能力的快速增强，以及葡萄糖利用从能量生产向生物合成和抗氧化防御的重新定向。尽管OXPHOS增强，神经元仍保留糖酵解活性，表现出代谢灵活性。

这项研究的重要意义在于：首先，它首次在NGN2-iNs模型中系统性地定义了早期代谢重塑的时间线和特征，将第一周确立为代谢专业化的关键期。其次，研究确立了NGN2-iPSC衍生的皮层神经元作为一个代谢特征明确、功能可靠的模型，适用于研究神经发育和线粒体疾病。该模型均质、可重复，避免了胶质细胞等非神经元细胞的干扰，能够直接解析神经元内在的代谢轨迹。最后，研究所采用的多模式分析框架（蛋白质组学、呼吸测量、FLIM、代谢流）为未来研究神经发育障碍中的代谢异常提供了强大的方法学参考。例如，对于Leigh综合征、CDKL5缺乏症、帕金森病（PARK2突变）等与线粒体功能障碍或氧化应激相关的疾病，该模型可用于模拟疾病表型、筛选治疗靶点。此外，该系统的代谢灵活性也使其成为研究营养应激（如GLUT1缺乏症、生酮饮食干预）下神经元适应机制的理想平台。

当然，研究也存在一些局限性，例如缺乏体内环境的复杂性（如胶质细胞、三维结构），未涵盖所有神经元亚型，以及未通过通路特异性扰动实验验证因果关系等。未来的研究可通过与星形胶质细胞共培养、开发3D类器官模型、延长观察时间至突触成熟期以及进行机制性干预来进一步深化理解。尽管如此，本研究为理解人类神经发育早期的能量代谢编程提供了宝贵的见解，并为相关疾病模型的建立和药物筛选奠定了坚实的基础。