靶向ASAH1/酸神经酰胺酶恢复GBA1突变帕金森病患者多巴胺神经元α-突触核蛋白清除的作用与机制研究

《Human Molecular Genetics》：Inhibition or genetic reduction of ASAH1/acid ceramidase restore α-synuclein clearance in mutant GBA1 dopamine neurons from Parkinson’s patients

本研究针对GBA1基因突变导致α-突触核蛋白(α-synuclein)清除障碍这一帕金森病(PD)关键病理环节，通过药理学抑制和基因敲低ASAH1/酸神经酰胺酶(ACDase)，发现能够显著恢复突变神经元内TFEB核定位、增强自噬流、提升组织蛋白酶D(CathD)表达，从而有效清除致病性α-synuclein/pS129寡聚体和单体。该研究发表于《Human Molecular Genetics》，为GBA1相关PD提供了新的治疗靶点。

　　

在探索帕金森病发病机制的过程中，科学家们发现了一个令人瞩目的遗传风险因素——GBA1基因突变。GBA1基因编码的β-葡萄糖脑苷脂酶(GCase)是溶酶体中的关键酶，其功能缺陷不仅导致戈谢病(GD)，更使携带者罹患帕金森病的风险提高5%-20%。尤其值得注意的是，约7%的帕金森病患者携带GBA1突变，这些患者往往发病更早、症状更重。然而，并非所有GBA1突变携带者都会发展为帕金森病，这一低外显率现象表明，除了GCase活性下降外，还有其他因素在疾病发生中扮演重要角色。

α-突触核蛋白的异常聚集是帕金森病的标志性病理特征，而溶酶体功能异常被认为是导致这些蛋白聚集物无法有效清除的关键因素。转录因子EB(TFEB)作为溶酶体生物生成和自噬过程的主要调节因子，其活性受到mTORC1信号的严密调控。在GBA1突变的情况下，mTOR激酶异常活化，导致TFEB滞留在细胞质中无法进入细胞核，进而影响组织蛋白酶D(CathD)等溶酶体水解酶的生成，最终削弱了细胞清除α-突触核蛋白的能力。

先前的研究表明，在神经元病变型戈谢病中，神经毒性脂质葡萄糖神经鞘氨醇(GluSph)的积累是驱动疾病进程的关键因素。酸神经酰胺酶(ACDase)由ASAH1基因编码，负责将葡萄糖神经酰胺(GluCer)转化为GluSph。那么，ACDase是否也在GBA1相关帕金森病的发病机制中发挥作用？这一问题成为了本研究关注的焦点。

为了回答这一科学问题，研究人员利用来自三名GBA1杂合突变帕金森病患者(RecNcil/WT、L444P/WT、N370S/WT)的诱导多能干细胞(hiPSCs)分化为中脑多巴胺神经元(GBA1/PD-DA)，并设置了同基因校正的WT/WT对照组。通过一系列精心设计的实验，研究团队从药理学和遗传学两个层面探究了ACDase/ASAH1在GBA1/PD发病机制中的作用。

在研究技术方法上，作者主要运用了hiPSC定向分化为多巴胺神经元技术、免疫印迹(WB)分析、免疫荧光染色与共聚焦显微镜分析、CRISPR/Cas9基因敲低技术以及酶活性测定等关键技术。这些方法的组合应用使得研究能够在人类细胞模型中精确评估ACDase抑制对帕金森病相关病理表型的挽救效果。

ACDase抑制剂降低GBA1/PD-DA神经元中的α-突触核蛋白聚集

研究首先评估了三种不同的ACDase抑制剂(22 m、ARN14988和LCL521)对α-突触核蛋白聚集的影响。免疫印迹分析显示，与同基因对照组相比，三种GBA1突变型DA神经元中磷酸化α-突触核蛋白(pS129)的单体和寡聚体水平均显著升高。经过10天的ACDase抑制剂处理后，所有三种突变神经元中的致病性α-突触核蛋白物种均显著减少。这一结果在RecNcil/WT、L444P/WT和N370S/WT三种不同基因型的神经元中均得到验证，表明ACDase抑制剂的效应具有普遍性。

CRISPR/Cas9敲低ASAH1在杂合GBA1/PD-DA神经元中阻止α-突触核蛋白聚集的形成

为了排除药理学抑制剂可能存在的脱靶效应，研究团队利用CRISPR/Cas9技术对ASAH1基因进行敲低(KD)。Western blot分析显示，ASAH1 KD使三种突变GBA1/PD细胞系中的ACDase蛋白水平降低了约40%-50%。值得注意的是，研究人员未能获得ACDase降低超过40%-50%的克隆，提示该酶可能对hiPSC克隆的存活至关重要。基因敲低实验结果显示，ASAH1 KD显著降低了RecNcil/WT、L444P/WT和N370S/WT DA神经元中α-synuclein/pS129高水平寡聚体和单体的含量，与药理学抑制实验结果高度一致。

ACDase抑制和ASAH1敲低增加GBA1/PD-DA神经元中TFEB的核定位

TFEB是调节溶酶体功能的关键转录因子，其核定位对激活自噬溶酶体通路(ALP)至关重要。共聚焦显微镜分析显示，与同基因对照相比，RecNcil/WT DA神经元中TFEB的核定位平均荧光强度(MFI)显著降低。用ARN14988、22 m和LCL521处理突变细胞后，TFEB的核定位显著增加。类似地，ASAH1 KD也部分挽救了RecNcil/WT神经元中TFEB的核定位。这些效应在L444P/WT和N370S/WT神经元中也得到证实，表明ACDase调控TFEB核定位的作用在不同GBA1突变背景下具有一致性。

ACDase抑制和ASAH1 KD挽救CathD表达

CathD是一种参与α-突触核蛋白降解的溶酶体蛋白酶，其表达受TFEB调控。免疫荧光分析显示，RecNcil/WT DA神经元中的CathD水平比同基因对照低约60%。ACDase抑制剂处理显著提高了这种水解酶的表达，其中ARN14988和脑屏障穿透性抑制剂22 m的效果优于LCL521。ASAH1 KD同样显著提高了所有三种GBA1/PD-DA神经元系中的CathD水平。

ACDase抑制和ASAH1 KD恢复GBA1/PD-DA神经元中的自噬流

自噬缺陷是帕金森病的另一个重要病理特征。SQSTM1/p62是一种将蛋白聚集体带到自噬体的适配蛋白，其积累反映自噬流受阻。Western blot分析显示，RecNcil/WT、L444P/WT和N370S/WT GBA1/PD-DA神经元中的p62水平均高于同基因对照，而三种ACDase抑制剂均能显著降低p62。此外，ASAH1 KD也能将DA神经元中的p62水平降低至同基因对照水平。

讨论与结论部分指出，本研究通过同基因hiPSC系统评估了ACDase作为GBA1相关帕金森病潜在治疗靶点的价值。药理学和遗传学抑制ACDase均能逆转GBA1杂合突变多巴胺神经元的表型异常，通过挽救TFEB依赖性溶酶体功能来增加神经毒性α-突触核蛋白物种的清除。

尽管神经元病变型戈谢病和GBA1/帕金森病具有不同的临床表现，但GBA1突变均导致mTORC1/TFEB/ALP级联反应的失调，表明由突变GBA1引起的神经系统疾病可能存在重叠的疾病机制。在神经元病变型戈谢病中，神经毒性代谢物GluSph在脑中大量积累，而ACDase抑制剂的挽救作用可能与其阻止神经毒性GluSph形成的能力有关。

值得注意的是，ASAH1缺陷会导致法伯病(FD)和脊髓性肌萎缩伴进行性肌阵挛性癫痫(SMA-PME)，这表明ACDase活性需要精确调控。本研究中将ACDase蛋白水平降低至对照的40%-50%并未导致DA神经元可观察到的细胞毒性，且体内研究表明22 m在显示靶点参与度的剂量下无毒性，这为ACDase抑制剂的临床转化提供了一定的安全性依据。

综上所述，本研究提供了药理学和遗传学证据，表明ACDase参与调节与α-突触核蛋白清除相关的ALP功能，进一步提示ACDase可能是改善或治疗GBA1相关帕金森病的潜在治疗靶点。这一发现为开发针对GBA1相关帕金森病的新型治疗方法奠定了重要基础。