FUS纳米团簇：揭示液液相分离新中间态的独特物理特性与生物学意义

《Nature Communications》：FUS nanoclusters are a distinct state within the dilute phase

本研究针对FUS蛋白液液相分离（LLPS）早期动力学机制不清的问题，通过优化预切割蛋白纯化技术，结合动态光散射（DLS）、荧光关联光谱（FCS）及单团簇下拉（SiCluP）等生物物理方法，首次系统表征了FUS在稀相中形成的纳米团簇（直径~300-500 nm）。该中间态具有瞬时形成、快速分子交换、抗1,6-己二醇溶解等特性，且其形成临界浓度（~200 nM）远低于饱和浓度（Csat）。研究明确了纳米团簇作为LLPS通路中的关键中间态，为神经退行性疾病相关蛋白聚集机制提供了新视角。

　　

在细胞的生命活动中，蛋白质通过液液相分离（Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS）形成无膜细胞器（如核仁、应激颗粒等），这一过程在基因转录、DNA损伤修复等生理过程中扮演关键角色。FUS（Fused in Sarcoma）作为一种高度无序的RNA结合蛋白，其相分离异常与肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）等神经退行性疾病密切相关。然而，传统研究多聚焦于FUS浓缩相（如微米级液滴）的性质，对稀相中蛋白的早期组装行为知之甚少。尤其令人困惑的是，在低于饱和浓度（C_sat）的条件下，FUS能否形成稳定的中间态？这些中间态是否具有独特的物理化学特性？这些问题成为理解FUS相分离路径与疾病关联的瓶颈。

为攻克这一难题，约翰斯·霍普金斯大学与哈佛医学院联合团队在《Nature Communications》发表最新研究，通过创新蛋白制备策略与高精度生物物理技术，首次揭示了FUS在稀相中形成的纳米团簇（nanoclusters）作为一种独立于浓缩相的中间态，其形成动力学、分子交换特性及化学耐受性均显著区别于传统液滴。这一发现不仅深化了对LLPS多步组装机制的理解，也为靶向相分离异常的药物开发提供了新思路。

研究团队首先优化了FUS蛋白纯化流程，通过预切割（Pre-Cleavage, PC）技术获得无标签FUS，避免了传统酶切（TEV Cleavage, TC）效率低对早期动力学测量的干扰。随后，他们整合动态光散射（DLS）、荧光关联光谱（FCS）和自开发的单团簇下拉（SiCluP）技术，系统量化了纳米团簇的尺寸分布、形成临界浓度、组装速率及分子交换动力学。此外，通过荧光恢复后漂白（FRAP）和化学扰动实验（如1,6-己二醇、NaCl处理），进一步揭示了纳米团簇的液体性质及其分子相互作用网络。

预切割技术揭示FUS相分离早期动力学

通过对比PC-FUS与TC-FUS的相行为，研究发现PC-FUS的纳米团簇形成临界浓度低至200 nM，远低于TC-FUS的1 μM。DLS与FCS数据一致表明，纳米团簇（直径100-1000 nm）在稀释条件下瞬时形成，且其尺寸随蛋白浓度增加而增大，直至达到C_sat后出现微米级冷凝物。

纳米团簇与冷凝物的动力学差异

SiCluP实验显示，纳米团簇在形成后30分钟内尺寸增长趋于平衡（直径约500 nm），而冷凝物则持续粗化。实时组装监测进一步证实，纳米团簇的组装速率显著低于冷凝物，表明二者受不同动力学机制调控。

纳米团簇的液体特性与分子交换

通过双色标记纳米团簇混合实验与FRAP分析，研究发现纳米团簇内部分子可在秒级时间内与周围溶液交换，其表观扩散系数（D_app）与冷凝物相当（~10^?4 μm²/s），证明其具备液体样流动性。

化学扰动揭示相互作用网络差异

高盐（>300 mM NaCl）可同时溶解纳米团簇与冷凝物，表明静电相互作用对两者稳定性均至关重要。然而，疏水干扰剂1,6-己二醇在0.2%浓度下即可破坏冷凝物，而纳米团簇在2%浓度下仍稳定存在，提示疏水作用在冷凝物形成中起主导作用，而非纳米团簇。

RNA调控纳米团簇尺寸与相变动力学

添加50聚尿苷酸RNA（U50）可加速纳米团簇向冷凝物转变，且纳米团簇尺寸随RNA浓度增加呈先增后减的“重入”效应。在ALS相关突变体（G156E）中，纳米团簇尺寸显著减小，暗示其与疾病病理的相关性。

本研究通过多尺度实验验证了FUS纳米团簇作为相分离路径中的关键中间态，其独特的形成阈值、动力学特性及化学耐受性均区别于传统冷凝物。纳米团簇的发现不仅完善了LLPS理论模型，还为解析病理条件下蛋白聚集的早期事件提供了新视角。未来针对纳米团簇与RNA或其他分子伴侣互作的研究，有望揭示其在神经退行性疾病中的具体作用机制。