综述：构建基因组相互作用图谱与功能解析之间的桥梁

《Advanced Biology》：Engineering the Link: From Genome Interaction Maps to Functional Insight

3D基因组结构调控基因表达，染色体构象捕获测序技术揭示了增强子-启动子环等机制，但因果关系尚未明确。本文系统综述了通过CRISPR/dCas9等工具工程化染色体环的技术进展，包括可诱导的ZFP-TALE融合蛋白、光控双组分系统LADL、化学诱导的CLOuD9和基于点击化学的BPCL平台，分析了各技术的效率、可扩展性和特异性局限，并探讨了未来结合AI蛋白设计和标准化评估的发展方向。

　　3D基因组的组织构成了信息处理的空间层，这不仅有助于调控基因表达，也深刻影响着细胞的功能。近年来，随着染色体构象捕捉测序技术（如Hi-C、Capture-C、Micro-C等）的发展，科学家们能够更全面地解析染色质结构，从增强子与启动子之间的环状联系到拓扑结构域（TADs）以及更高阶的染色质接触。尽管这些技术使我们能够描绘出染色质的结构，但其与细胞功能之间的因果关系仍未完全厘清。因此，有必要通过基因组工程手段，特别是针对DNA环的可编程操控，来探索这些结构与功能之间的直接联系。

染色质环的形成与多种机制相关，包括蛋白介导的动态折叠、相分离、环挤压等。这些机制在不同细胞类型和发育阶段中展现出高度的可塑性和特异性，说明基因组的三维结构并非静态，而是随着细胞状态和信号环境不断变化。同时，这些结构的异常与多种疾病密切相关，如发育障碍、癌症等，表明它们在维持正常的基因调控中起着至关重要的作用。因此，对染色质环进行精确操控不仅有助于理解其在基因调控中的作用，也为疾病模型构建和基因表达调控提供了新的可能。

为了实现对染色质环的操控，科学家们开发了多种策略。其中，基于DNA结合蛋白的合成方法成为主流。例如，通过将锌指蛋白（ZFPs）与LDB1的自结合结构域（SA domain）融合，可以定向地将增强子与启动子拉近，从而形成特定的染色质环。类似地，转录激活因子样效应物（TALEs）也被用于这一目的，其模块化的结构使其能够灵活地识别不同的DNA序列。然而，这些方法在效率、可扩展性和特异性方面仍面临挑战。ZFPs需要复杂的工程设计和克隆，而TALEs虽然更容易编程，但其较大的体积和重复结构可能限制其在高通量应用中的使用。

随着CRISPR技术的兴起，基于CRISPR的染色质环操控方法也逐渐发展起来。例如，dCas9-Zips系统通过将两个不同的dCas9同源物与互补的亮氨酸拉链融合，实现了在细菌中的染色质环诱导。而CLOuD9系统则利用ABA诱导的PYL1-ABI1二聚化，实现了在哺乳动物细胞中的可逆、可调控的染色质环形成。LADL系统则借助蓝光诱导的CRY2-CIBN光二聚化，实现了对特定染色质环的快速调控。BPCL系统则采用生物正交点击化学和sgRNA介导的适配器，实现了多个染色质环的精准组装。相比之下，dgRNA系统则通过单个双引导RNA（dgRNA）同时招募两个dSpyCas9蛋白，实现了更紧凑的设计，但目前仅在细菌中验证。

尽管这些方法在特定实验体系中表现出良好的效果，但在实际应用中仍存在一些局限性。例如，dCas9-Zips和CLOuD9系统虽然能够诱导特定的染色质环，但它们依赖于两个不同的dCas9蛋白，增加了表达和递送的复杂性。BPCL系统虽然支持多路复用，但需要额外的生物正交化学试剂，限制了其在活细胞中的广泛应用。而dgRNA系统虽然设计紧凑，但尚未在哺乳动物细胞中得到验证。此外，许多方法依赖于静态的相互作用，无法实现时间上的精确控制。因此，开发更加灵活、可扩展且可逆的工具成为当前研究的重点。

为了克服这些挑战，研究人员正在探索多种新的策略。例如，开发更紧凑的CRISPR效应蛋白，如CasX、Cas12e、CasΦ和Cas12j，这些蛋白具有更小的体积，可能更适合高通量应用。此外，利用自然进化的双功能RNA系统，如桥接RNA，也可能为合成双特异性染色质连接提供新的思路。同时，基于人工智能的蛋白质工程方法正在加速发展，有望设计出更高效、更精确的DNA结合蛋白，从而实现更广泛的染色质环操控。

在疾病模型构建和治疗策略方面，可编程染色质环技术也展现出巨大的潜力。例如，通过人工构建特定的染色质环，可以模拟病理条件下的异常调控，从而验证其是否足以导致基因表达紊乱。此外，某些疾病，如地中海贫血，可以通过重新定向增强子连接，实现对特定基因表达的调控，而无需改变编码序列。这种策略为开发非侵入性的治疗方法提供了新的方向。

随着技术的不断进步，3D基因组工程正逐渐成为合成生物学的核心工具之一，与传统的序列编辑技术形成互补。未来，通过进一步优化这些工具，我们有望实现对基因组结构的精确编程，从而更深入地理解基因调控的机制，并在疾病治疗中发挥更大作用。同时，建立统一的评估标准和定量指标，将有助于不同技术之间的比较和优化，推动该领域的标准化发展。

总之，3D基因组工程不仅能够揭示基因调控的复杂机制，还为疾病模型的构建和治疗策略的创新提供了新的可能。随着技术的成熟，我们期待这些工具能够帮助科学家们更精确地操控染色质结构，从而实现对基因表达和细胞状态的理性设计。这将使我们能够更全面地解析基因组的调控网络，并最终实现对基因组结构的精准调控。