通过针对REF1基因组的靶向编辑技术降低Camelina sativa种子中的酪胺酸水平

《Plant Biotechnology Journal》：Reducing the Sinapine Levels of Camelina sativa Seeds Through Targeted Genome Editing of REF1

通过CRISPR/Cas9技术敲除 Camelina sativa 的三个 REF1 同源基因，成功将种子中 sinapine 含量降低56%，同时不影响油脂、蛋白质含量及种子农艺性状。代谢组学显示，种子中 sinapoyl β-葡萄糖等代谢物减少，而叶片中氯ogenic 酸等代谢物发生改变，表明 REF1 在种子和叶片中具有不同的代谢功能。

　　近年来，随着对可持续农业和生物能源需求的不断增长，油菜籽作为一种重要的植物油来源，受到了越来越多的关注。特别是在油菜（*Brassica napus*）和拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）中，sinapine（一种重要的酚类代谢产物）的合成被认为是与植物防御机制密切相关的。然而，sinapine的存在也导致了油菜籽在动物饲料中的使用受限，因为其苦味和潜在的抗营养性，使得油菜籽不适合作为高价值饲料原料。为了改善油菜籽的品质，研究者们尝试通过基因编辑技术，特别是CRISPR/Cas9，来减少sinapine的含量。这种技术的引入为作物改良提供了新的途径，不仅提高了作物的营养价值，也促进了其在农业中的应用。

在研究过程中，科学家们首先聚焦于一个关键基因——*REF1*（*REDUCED EPIDERMAL FLUORESCENCE1*），该基因编码一种NADP?依赖的coniferaldehyde/sinapaldehyde脱氢酶（CALDH/SALDH），在sinapine的生物合成中起着至关重要的作用。通过CRISPR/Cas9对*REF1*基因进行编辑，研究人员成功地降低了油菜籽中sinapine的含量，同时没有对种子的其他关键农艺性状（如总脂质、蛋白质含量、种子重量和发芽率）造成负面影响。这一发现表明，通过基因编辑手段减少sinapine的含量，可以有效提升油菜籽的使用价值，尤其是在作为人类食用或动物饲料方面。

此外，研究还发现，油菜籽中存在一个与*REF1*无关的sinapine生物合成途径。这种现象在油菜籽中尤为明显，因为在其他物种如拟南芥中，*REF1*的失活会导致sinapine含量显著降低，而在油菜籽中，即使三个*REF1*同源基因都被失活，sinapine的含量仍然没有完全消除。这表明，油菜籽中可能还存在其他酶或代谢通路，参与了sinapine的合成。这一发现对于进一步理解植物次生代谢产物的生物合成机制具有重要意义，并可能为其他作物的改良提供新的思路。

除了sinapine含量的降低，研究人员还对油菜籽的其他代谢产物进行了分析，以了解*REF1*基因失活对整个代谢网络的影响。通过超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱（UPLC-ESI-QTOF-MS）等先进的代谢组学技术，研究团队发现，*ref1*突变体在种子和叶片中表现出不同的代谢特征。例如，在种子中，一些与sinapine相关的代谢产物（如sinapoyl β-glucose）显著减少，而在叶片中，氯原酸（chlorogenic acid）的含量则有所增加。这些变化不仅揭示了*REF1*在不同组织中的不同作用，也说明了植物代谢通路的复杂性和多样性。

值得注意的是，氯原酸在油菜籽叶片中的积累与拟南芥和油菜籽的代谢模式不同。在拟南芥和油菜籽中，氯原酸通常在叶片中含量较低，而在油菜籽中，氯原酸却是一个重要的代谢产物，其含量显著高于其他物种。这种差异可能与油菜籽的生长环境、代谢通路的适应性或基因表达调控有关。研究团队还发现，氯原酸在不同油菜籽品种中存在不同的异构体，这可能是油菜籽品种间差异的一个代谢标志物。这一发现不仅有助于进一步理解油菜籽的代谢特征，也为未来品种改良提供了新的方向。

在实际应用方面，减少sinapine含量的油菜籽突变体在种子品质方面表现出良好的表现。不仅sinapine的含量显著降低，而且种子的其他关键农艺性状（如总脂质含量、蛋白质含量和发芽率）均未受到影响。这一结果表明，通过基因编辑手段减少sinapine的含量，可以有效地提高油菜籽的食用价值和饲料价值，同时不影响其生长性能。这为油菜籽作为可持续作物的进一步开发提供了坚实的基础。

此外，研究还揭示了*REF1*在不同组织中的不同功能。在种子中，*REF1*主要负责将sinapaldehyde氧化为sinapate，而在叶片中，*REF1*则可能将coniferyl aldehyde氧化为ferulate。这种组织特异性表明，植物的代谢通路是高度调控的，不同组织可能依赖不同的酶或代谢途径来完成特定的代谢功能。这一发现不仅加深了我们对植物代谢网络的理解，也为未来针对不同组织进行代谢调控提供了理论支持。

研究团队还对油菜籽的代谢组学数据进行了系统分析，以揭示*REF1*失活对整个代谢网络的影响。通过非靶向代谢组学分析，研究人员发现，*ref1*突变体在种子和叶片中表现出不同的代谢特征。例如，在种子中，一些与sinapine相关的代谢产物（如sinapoyl β-glucose）显著减少，而在叶片中，氯原酸的含量则有所增加。这些变化不仅揭示了*REF1*在不同组织中的不同作用，也说明了植物代谢通路的复杂性和多样性。

总的来说，这项研究不仅揭示了*REF1*在油菜籽中sinapine生物合成中的关键作用，还发现了*REF1*失活对其他代谢产物的影响。通过基因编辑手段减少sinapine含量，不仅提高了油菜籽的品质，也为未来作物改良提供了新的策略。同时，研究还表明，植物代谢通路的高度复杂性意味着不同组织可能依赖不同的代谢机制来完成其特定的功能。这一发现为植物代谢调控的研究提供了新的视角，并可能为其他作物的改良提供参考。