可穿戴光声显微技术实现自由活动小鼠脑卒中代谢超快成像

《Cell Reports Physical Science》：Wearable photoacoustic microscopy for ultrafast stroke metabolic imaging in freely moving mice

本研究针对传统脑卒中模型受麻醉或头部固定干扰、无法实时观察自由活动动物神经血管耦合与行为变化的问题，开发了头戴式双波长光声代谢显微镜(PHM)。该系统可在单血管水平实时定量血红蛋白浓度(CHb)和血氧饱和度(sO2)，成功追踪了光血栓形成(PT)过程中的动态闭塞/再通事件，并发现神经血管解耦先于行为缺损。该技术为卒中研究和脑疾病机制探索提供了变革性工具。

　　

在探索大脑奥秘的征程中，科学家们一直渴望能够实时观察活体动物在自由活动状态下的大脑代谢变化，尤其是脑卒中（中风）这种急性脑血管疾病的发生发展过程。脑卒中作为全球致残和致死的主要原因之一，其中缺血性脑卒中约占全部病例的80%，每年导致约550万人死亡。尽管医学界对卒中病理生理过程已有基本认识，但现有成像技术存在明显局限——要么需要麻醉动物（这会改变大脑正常生理状态），要么要求固定头部（限制了自然行为观察），使得研究人员难以在真实生理条件下捕捉脑缺血早期的关键动态变化。

传统成像技术如激光散斑对比成像(LSCI)、双光子显微镜、光学相干断层扫描(OCT)等虽然各具优势，但都无法同时满足高时空分辨率、无创监测和自由活动观察的需求。特别在研究神经血管耦合（神经活动与脑血流之间的精确调节关系）这一关键机制时，这种技术局限更为突出。而光声成像(PAI)作为一种新兴的生物医学成像技术，结合了光学对比度和超声穿透深的优点，为解决这一难题带来了希望。

在此背景下，澳门大学袁振教授团队与南方科技大学奚雷教授团队合作，在《Cell Reports Physical Science》上发表了最新研究成果。他们开发了一种重量仅2.3克的头戴式光声代谢显微镜(PHM)，首次实现了在自由活动小鼠脑中实时、单血管水平的代谢成像，为卒中研究提供了全新视角。

研究人员采用了几项关键技术方法：首先设计了双波长（532nm和558nm）激光激发系统，通过差分吸收法量化氧合血红蛋白(HbO₂)和脱氧血红蛋白(Hb)，从而计算血氧饱和度(sO₂)；其次利用微机电系统(MEMS)扫描器实现双螺旋扫描，在保持3Hz时间分辨率的同时获得超过8mm2的视场；系统集成行为追踪模块，通过深度学习算法（YOLOv5）实时分析小鼠运动轨迹；研究还建立了可调控严重程度的光血栓形成(PT)模型，通过精确控制玫瑰 Bengal染料浓度和激光照射区域，模拟从轻微到严重的不同卒中类型。

PHM系统和行为监测

研究人员开发了一套集成成像和行为监测系统，其核心是重量仅2.253克的头戴式探头，通过磁耦合方式与小鼠颅窗固定基座连接。该系统采用双波长激光激发，通过差异吸收特性计算sO₂，其中532nm波长信号反映总血红蛋白浓度(C_Hb)变化。系统横向分辨率达14μm，视场直径超过3.1mm，能够清晰分辨小鼠耳部血管的C_Hb和sO₂分布。行为学验证表明，佩戴探头的小鼠仍保持自然探索活动模式，证明该装置对动物行为影响极小。

脑栓塞诱导和PHM成像程序

研究采用光血栓形成(PT)模型，通过系统注射玫瑰 Bengal染料后选择性激光照射，诱导特定脑血管闭塞。该模型可实现单血管或区域栓塞，通过可视化选择扫描区域模拟不同严重程度的栓塞。实验流程包括颅窗植入、7天恢复期、脑血管成像与目标选择、精确扫描定位与栓塞诱导、以及后续监测。实时成像显示，栓塞过程中血管直径逐渐减小，伴随血栓形成直至完全闭塞，C_Hb和sO₂呈现动态下降过程。

体内实验验证

通过单血管建模实验，研究人员观察到血管阻塞并非线性进展，而是经历短暂闭塞-收缩-部分血流恢复的反复循环，最终在10分钟时完全中断。行为分析显示，脑栓塞期间小鼠运动显著减少，且呈现时间依赖性模式：最初活跃，随后出现约2分钟不动期，之后短暂恢复活动，最终在6分钟时完全不动。C_Hb和sO₂定量变化显示整体下降趋势伴有明显波动，与观察到的血管变化一致。24小时后成像确认目标血管完全闭塞，下游出现明显缺氧区，行为学显示运动功能持续受损。MRI和TTC染色进一步验证了梗死灶的形成。

严重区域栓塞模型与纵向研究

针对严重局部脑栓塞，研究人员选择了动脉-静脉血管交错区域（直径约800μm）作为目标。发现动脉血管比静脉血管具有更强的血栓清除能力，在栓塞过程中经历动态闭塞-再通-再闭塞的波动变化。小鼠在栓塞诱导后立即停止运动，与血流动力学参数快速下降直接相关。7天纵向监测显示，栓塞后第1天矢状窦急性破坏变薄，栓塞区血管稀疏、sO₂降低并出现脑出血；第2-3天矢状窦进行性狭窄，缺血半球出血吸收并出现新生血管；第7天矢状窦直径部分恢复但未完全再通。运动功能在第1天严重低下，第2天接近不动，第3-7天逐渐部分恢复。

定量分析显示脑sO₂呈三相模式：急性缺氧期（急剧下降）、代偿性充血期（强劲反弹）和稳定期（逐渐正常化）。血管复杂性先升高后下降，平均血管直径持续减少至第3天，分支点密度显著增加反映代偿性血管增殖。基于种子的相关性分析显示：第1天连接性紊乱广泛增加，第2天出现结构化血管网络相关性，第3天开始正常化，第7天保持局部连接而远端连接减弱。强连接区域与高sO₂区域空间对应，提示血流动力学驱动的网络重组。

可恢复微血管栓塞与纵向研究

通过精确调整玫瑰 Bengal剂量和选择微血管区域（建模区约150μm直径），研究人员建立了轻度可恢复栓塞模型。建模前4分钟C_Hb和sO₂轻微波动并逐渐下降，4-5分钟间急剧下降后稳定在较低水平。小鼠活动主要集中在前5分钟，之后基本静止。右脑血管闭塞诱导了明显的向左运动偏斜，符合脑栓塞典型行为表现。

28天随访显示，第1-3天目标半球闭塞明显，血红蛋白振幅升高而sO₂降低，部分血管出现短暂sO₂升高；第3天建模区血管形态和功能几乎丧失；第7天充血缓解，先前闭塞血管结构和功能恢复，建模半球出现新生血管；第14天脑血管近乎完全恢复，第28天所有参数稳定。行为学显示栓塞后立即抑制，随血管恢复逐步改善。功能连接分析表明，第1天建模区与周围血管连接性显著降低，第28天基本恢复，且多个血管与种子的相关性从弱变强，提示这些血管在功能恢复中可能发挥代偿作用。

本研究开发的PHM-PT技术成功解决了传统脑卒中研究中麻醉干扰和行为限制的核心问题。该系统的三大创新——超紧凑设计（<2.3g）与大视场（>8mm2）、双波长激发实现定量C_Hb/sO₂ mapping at 3Hz、血管闭塞与行为的闭环分析——为自由活动动物的神经血管研究建立了新标准。

研究结果表明，神经血管解耦先于行为缺损出现，且功能连接重组持续到血管再通之后，这为理解卒中后脑功能恢复提供了重要线索。通过建立从轻微到严重的不同程度栓塞模型，该技术不仅适用于卒中研究，还为阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病中的脑血管机制研究提供了新工具。

未来通过扩大成像视场、集成透明超声换能器以及结合钙成像等多模态技术，该平台有望进一步深化对神经血管耦合机制的理解。这项技术突破了传统成像技术的局限，实现了在自然行为状态下对脑代谢的动态监测，为脑血管疾病研究和治疗策略开发提供了强有力的技术支撑。