单细胞突触组图谱解析哺乳动物大脑内源性蛋白亚群的空间与动态分布

《Nature Communications》：Single-cell synaptome mapping of endogenous protein subpopulations in mammalian brain

本研究开发了一种基于CRISPR-Cas9介导的蛋白质标记与化学标签技术的平台，实现了对活体或固定小鼠脑内单个神经元中数千个突触的内源性蛋白（如受体、支架蛋白）的空间（胞膜/胞内）与时间（现存/新生）亚群的高分辨率成像。该技术首次在单细胞层面绘制了突触蛋白异质性的全脑图谱，为揭示神经元计算与神经系统疾病机制提供了新视角。

　　

神经元通过数千个突触接收并整合信息，而突触的功能多样性取决于其蛋白组成、定位与动态周转的异质性。传统技术难以在单细胞分辨率下同时解析内源性蛋白的空间（如胞膜表面与胞内库）与时间（如现存与新生）亚群，限制了人们对突触可塑性机制的理解。为此，日本新潟大学等团队在《Nature Communications》发表研究，开发了一种整合CRISPR-Cas9基因编辑、化学标签标记与半自动分析流程的平台，实现了对哺乳动物大脑单神经元内源性蛋白亚群的定量图谱绘制。

研究通过优化SLENDR/vSLENDR方法，将HaloTag或SNAP-tag精准插入靶蛋白基因位点，利用细胞通透性差异的荧光配体（如膜不透性FLAG2-JF646-HTL标记表面蛋白，膜通透性JF549-HTL标记胞内蛋白）及脉冲追踪标记策略，分别可视化AMPAR、NMDAR、PSD95、CaMKIIα等关键突触蛋白的亚群。结合深度学习算法对厚脑片（300 μm）中数千个突触点进行自动识别，首次在单细胞层面绘制了蛋白分布、周转与运输的全景图谱。

主要技术方法

研究通过子宫内电穿孔将CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物与同源重组模板导入小鼠皮层神经元，实现HaloTag/SNAP-tag对内源性蛋白的标记；利用有机荧光配体（如Janelia Fluor染料）进行多色标记；采用脑片透明化（SeeDB2G）与结构光照明显微镜（SIM）提升成像深度与分辨率；通过脉冲追踪标记与活体双光子成像动态监测蛋白周转；基于深度学习算法半自动分析突触点信号。

单细胞化学标签标记内源性蛋白

研究团队通过RNP（核糖核蛋白）复合物递送策略显著提高了HaloTag在内源基因（如CaMKIIα、GluA2、βActin）中的敲入效率。标记后的蛋白在神经元树突棘中富集，且与兴奋性突触标志物共定位，验证了技术的特异性。超分辨成像进一步揭示了GluA2在突触后致密区的纳米簇结构。

全神经元尺度突触组图谱

在透明化脑片中，研究人员对单个皮层神经元中3016个Halo-GluA2标记的突触进行定量分析，发现突触密度在距胞体25–75 μm处最高，但信号强度与变异系数在树突分段中无显著差异，表明不同神经元存在特有的突触蛋白分布模式。

内源性AMPAR与NMDAR亚群的定量分析

通过膜不透性与通透性配体的双重标记，研究发现表面GluA2（sHalo-GluA2）与胞内GluA2（iHalo-GluA2）在树突棘中的强度均与棘头体积正相关，且两者高度同步。在SynGAP1敲除模型中，细胞内GluA2池显著减少，表明突触可塑性受损具有全局性。

多蛋白同步标记与功能关联

双标记实验显示，PSD95-SNAP与表面GluA2在突触中共分布，但GluA2信号密度变异更大。小突触中PSD95与GluA2的比值波动更显著，提示“沉默突触”（富含NMDAR但缺乏AMPAR）的存在。此外，脉冲追踪标记发现新生PSD95在少数突触中特异性富集，而βActin的现存与新生亚群分布高度一致，反映了不同蛋白的周转异质性。

活体成像揭示蛋白动态周转

通过活体双光子显微镜与脉冲追踪标记，研究观察到视觉皮层神经元中CaMKIIα的现存池在2小时内降解约30%，而新生池在蛋白合成抑制剂anisomycin处理后消失，证实了技术对蛋白动态监测的可靠性。

结论与意义

该研究建立的单细胞突触组图谱平台突破了传统技术难以同时解析内源性蛋白多维度亚群的瓶颈，首次在单神经元尺度揭示了突触异质性的空间组织规律。研究发现突触强度与蛋白周转模式并非均匀分布，而是呈现高度多样性，且在不同疾病模型（如SynGAP1敲除）中表现出全局性改变。这一技术为深入理解学习记忆的分子基础、神经发育疾病机制及神经元计算原理提供了强大工具，未来结合钙成像或行为学模型有望进一步揭示特定功能环路的突触动态调控机制。