排斥性导向信号与GPR180在儿童低级别胶质瘤浸润中的作用及机制研究

《npj Precision Oncology》：Role of repulsive guidance signaling and GPR180 in pediatric low-grade glioma infiltration

本研究针对儿童低级别胶质瘤(pLGG)浸润性强导致手术全切困难、预后恶化这一临床难题，通过构建五种果蝇pLGG模型，发现QKI::RAF1融合基因可诱导胶质细胞异常迁移。研究揭示排斥性导向信号(如Robo2/PlexA/B)下调及G蛋白偶联受体GPR180/CG9304上调共同驱动肿瘤浸润，并在人类患者数据中验证其临床相关性。该研究为RAF1/BRAF融合型pLGG提供了潜在治疗靶点，并建立了跨物种转化研究范式。

　　

在儿童脑肿瘤的谱系中，低级别胶质瘤(pLGG)虽然预后相对较好，却隐藏着一个棘手的临床困境：当肿瘤生长在脑部关键区域或呈现弥漫浸润性生长时，外科医生难以实现肿瘤全切除(GTR)，导致患儿10年无进展生存率从超过85%骤降至不足50%。传统放化疗虽可作为辅助手段，但可能对发育中的儿童大脑造成长期神经功能损伤。这一困境凸显了深入理解pLGG生物学特性、开发针对性治疗策略的迫切性。

随着精准医疗时代的到来，2011年世界卫生组织(WHO)对中枢神经系统肿瘤进行了分子病理学重新分类，强调基于分子特征进行诊断和治疗的重要性。儿童型弥漫性低级别胶质瘤因其独特的分子亚型和弥漫生长模式成为关注焦点。然而，针对不同pLGG亚型开发靶向治疗的主要障碍在于缺乏能够准确模拟肿瘤生物学特性的遗传模型。

为填补这一知识空白，研究团队选择黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)这一理想模式生物，构建了五种携带患者来源融合基因的pLGG模型。果蝇具有与人类高度保守的遗传背景、强大的遗传操作工具以及适合活体观察的优势，特别适合研究肿瘤的浸润性表型。研究人员通过胶质细胞特异性过表达QKI::RAF1、MKRN1::BRAF、FGFR1::TACC1、QKI::NTRK2和KIAA1549::BRAF五种融合基因，成功模拟了人类pLGG的关键特征。

在模型表征过程中，胶质细胞过表达QKI::RAF1融合基因诱导了显著的胶质细胞迁移缺陷，模拟了人类患者中导致手术全切困难的弥漫/浸润性肿瘤模式。QKI::RAF1是毛细胞星形细胞瘤和胶质神经元肿瘤中已知的驱动突变，通过激活MAPK通路促进肿瘤发生。值得注意的是，QKI::RAF1融合对第一、二代RAF抑制剂耐药，因此开发新治疗策略尤为重要。

研究团队聚焦于QKI::RAF1诱导的异常迁移现象，发现排斥性导向信号通路在这一过程中发挥关键作用。该通路包括roundabout(Robo)和plexin(Plex)跨膜受体及其配体Slit和Semaphorin，最初被发现参与轴突导向，后来证实也调控胶质细胞迁移。在果蝇模型中，胶质细胞共过表达Robo2或PlexA/B能够部分挽救QKI::RAF1诱导的迁移缺陷。进一步机制探索发现，在异常迁移的胶质细胞中，Robo2表达显著下调，而PlexA表达变化不显著。

跨物种验证显示，过表达QKI::RAF1的小鼠原代星形胶质细胞(PMAs)中Robo2、Plxna1、Plxna2和Plxnb3 mRNA表达下调。人类pLGG患者肿瘤数据分析证实，携带RAF1或BRAF融合的肿瘤中ROBO2表达显著低于无融合或QKI融合(非RAF1伙伴)的肿瘤。有趣的是，BRAF-V600E突变型pLGG中ROBO2表达未受影响，凸显了不同遗传变异驱动独特分子特征的多样性。

为系统探索pLGG融合基因的分子通路并识别新治疗靶点，研究人员进行了整合转录组分析。通过比较果蝇QKI::RAF1模型与儿童脑肿瘤图谱(PBTA)中人类pLGG患者的差异表达基因(DEGs)，发现87个在两种物种中共同差异表达的基因。通路富集分析显示，这些基因在与神经突触蛋白相互作用相关的通路中显著富集，可能与肿瘤-神经元相互作用有关。

通过候选基因筛选，研究团队发现了一个此前与胶质瘤无关的潜在靶点——G蛋白偶联受体GPR180(果蝇同源基因为CG9304)。在果蝇QKI::RAF1模型中，胶质细胞敲低GPR180/CG9304可显著抑制异常迁移表型，而不影响胶质细胞增殖或轴突路径寻找。插入突变CG9304^MI09328也证实了类似表型，表明GPR180/CG9304在QKI::RAF1融合背景下具有促浸润功能。

临床意义分析发现，GPR180 mRNA在BRAF融合型pLGG中表达显著富集，且与BRAF融合特有的蛋白质组和磷酸化蛋白质组特征高度相关。多参数MRI影像分析显示，GPR180高表达患者的增强实体瘤区域表现出更高的ADC平均值和均方根值，以及负偏态的ADC直方图分布，提示肿瘤微环境可能具有更高的间质水含量，可能与炎症反应增强有关。机器学习模型基于ADC特征区分GPR180高低表达组的能力较强(AUC-ROC=0.80)，表明影像特征有潜力作为GPR180表达的非侵入性生物标志物。

生存分析进一步揭示，在TCGA数据库中，低GPR180表达与成人低级别胶质瘤(LGG)患者更好的总生存期(OS)相关，特别是在星形细胞瘤亚型中，低GPR180表达不仅与更好OS相关，还与更长的无进展生存期(PFS)相关。CGGA数据集分析也支持这一发现，低GPR180表达患者在原发和复发胶质瘤中均显示更好的生存趋势。

值得注意的是，在果蝇神经母细胞肿瘤模型中敲低CG9304未引起明显表型变化，提示GPR180/CG9304的功能可能相对特异于胶质瘤谱系，强调了精准靶向不同肿瘤类型和分子亚型的重要性。

关键技术方法

研究采用多学科交叉技术路线：利用果蝇遗传学工具构建五种pLGG融合基因模型；通过活体成像和免疫组织化学分析肿瘤表型；运用转录组测序筛选差异表达基因；结合儿童脑肿瘤图谱(PBTA)、癌症基因组图谱(TCGA)和中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)等多中心人类患者数据进行临床验证；采用多参数MRI影像和放射基因组学方法分析肿瘤微环境特征。

研究结果

果蝇pLGG遗传模型过表达融合基因显示胶质细胞异常

通过胶质细胞特异性过表达五种患者来源融合基因，建立了果蝇pLGG模型。体内成像显示，dEGFR^ACT;dPI3K^ACT、QKI::NTRK2和FGFR1::TACC1过表达导致腹神经索(VNC)伸长，而dEGFR^ACT;dPI3K^ACT和MKRN1::BRAF过表达引起脑叶胶质细胞体积增加。免疫染色分析显示，dEGFR^ACT;dPI3K^ACT和KIAA1549::BRAF模型中总胶质细胞数量增加，MKRN1::BRAF和KIAA1549::BRAF模型中增殖胶质细胞(pH3⁺)显著增多。

QKI::RAF1诱导果蝇胶质细胞异常迁移

QKI::RAF1过表达引起第三龄幼虫腿成虫盘区域异常胶质细胞迁移，模拟了人类弥漫性pLGG的浸润表型。与野生型(WT)幼虫中胶质细胞沿神经束紧密排列不同，QKI::RAF1过表达导致胶质细胞延伸到成虫盘边缘。点突变实验表明，破坏QKI介导二聚化的QKI.E48G::RAF1和破坏RAF1激酶二聚化的QKI::RAF1.R401H均能减弱迁移表型，其中RAF1端的R401位点对致癌功能更为关键。

Robo2和PlexA/B挽救QKI::RAF1 pLGG模型中的胶质细胞迁移缺陷

排斥性导向信号分子Robo2或PlexA/B的胶质细胞共过表达部分改善了QKI::RAF1诱导的异常迁移。Robo2和PlexB同时过表达未产生叠加效应，提示二者功能部分重叠。免疫染色显示，QKI::RAF1幼虫中沿成虫盘边缘迁移的胶质细胞Robo2表达显著降低，而PlexA表达变化不显著。

QKI::RAF1过表达的小鼠星形胶质细胞和RAF融合pLGG显示Robo2表达降低

QKI::RAF1过表达的小鼠原代星形胶质细胞中Robo2、Plxna1、Plxna2和Plxnb3 mRNA表达显著下调。人类pLGG患者数据分析证实，RAF1/BRAF融合肿瘤中ROBO2表达低于无融合或QKI融合(非RAF1伙伴)肿瘤，而BRAF-V600E突变肿瘤中ROBO2表达未受影响。

整合转录组分析和候选遗传筛选揭示GPR180/CG9304为胶质瘤浸润调节因子

果蝇QKI::RAF1模型与人类RAF1/BRAF融合pLGG患者转录组比较发现87个共同差异表达基因。候选基因筛选表明，敲低GPR180/CG9304通过两个独立RNAi系均显著减少迁移长度。解剖学分析证实CG9304敲低或CG9304^MI09328突变均抑制异常迁移，而不影响胶质束面积。

GPR180表达与pLGG分子亚型及成人胶质瘤生存相关

GPR180 mRNA在BRAF融合型pLGG中显著富集，且与BRAF融合特有的蛋白质组和磷酸化蛋白质组特征高度相关。多参数MRI分析显示，GPR180高表达患者增强实体瘤区域ADC平均值和均方根值更高，直方图偏度更负。机器学习模型基于ADC特征区分GPR180高低表达组表现良好(AUC-ROC=0.80)。生存分析显示，低GPR180表达与成人LGG和星形细胞瘤患者更好OS和PFS相关。

研究结论与意义

本研究通过建立首个果蝇pLGG模型系统，揭示了排斥性导向信号和GPR180在RAF1/BRAF融合型pLGG浸润中的关键作用。研究表明，QKI::RAF1融合可能通过劫持正常胶质细胞迁移通路促进肿瘤浸润，类似于胶质瘤利用神经发育和可塑性通路的近期报道。

Robo2和PlexA/B过表达或GPR180敲低均能缓解果蝇异常迁移表型，表明它们是潜在治疗靶点。临床发现——RAF1/BRAF融合患者中异常ROBO2和GPR180表达，以及高GPR180表达pLGG患者ADC特征提示炎症反应增强，进一步支持ROBO2和GPR180作为治疗靶点的潜力。

研究建立的"果蝇模型-体外小鼠系统-人类患者组织/影像"转化研究管道，为开发针对pLGG患者的靶向治疗提供了可推广范式。尽管GPR180在胶质瘤中功能相对特异，其在更广泛肿瘤类型中的潜在作用仍需进一步探索。未来研究应着重阐明QKI::RAF1下调Robo2和上调GPR180的具体分子机制，以及GPR180是否作为更广泛的致癌驱动因子参与多种pLGG类型。

该研究发表于《npj Precision Oncology》，不仅为理解pLGG肿瘤发生提供了机制见解，更为RAF1/BRAF融合亚型提出了靶向排斥性导向信号和GPR180的潜在治疗策略，推动了分子靶向医学在儿童脑肿瘤领域的创新。